本文關(guān)鍵詞：ClipR-59在小鼠肌肉細胞分化過程中的功能研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

《中國農(nóng)業(yè)大學》 2015年

ClipR-59在小鼠肌肉細胞分化過程中的功能研究

孫英民  

【摘要】：ClipR-59(Cytoplasmic linker protein related59kD protein)是一種細胞膜蛋白,它有四個結(jié)構(gòu)域,分別為：N端富含谷氨酸和脯氨酸的E/P結(jié)構(gòu)域,Ankryin repeat結(jié)構(gòu)域,CAP-Gly(cytoskeleton-associated protein glycine-rich domain)結(jié)構(gòu)域和與細胞膜作用的Membrane Binding Domain即MBD結(jié)構(gòu)域。在脂肪細胞內(nèi),ClipR-59與Akt相互作用并增加其在細胞膜上的分布,提高AS160的磷酸化水平,促進Glut4分子的細胞膜移位；ClipR-59與TNF受體作用,通過調(diào)控TNFα信號傳導,進行調(diào)節(jié)細胞凋亡。研究證實,ClipR-59基因敲除小鼠在胚胎發(fā)育的后期會由于窒息而死亡。本研究就是以ClipR-59為誘餌,通過酵母雙雜交系統(tǒng),尋找與它相互作用的新蛋白,揭示其新功能,并闡釋其機制。 前人研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),Elmo2通過Elmo2-Dock180-Rac1信號通路調(diào)控肌細胞的融合。在篩選得到同ClipR-59相互作用的蛋白中,最終選擇了Elmo2蛋白進行后續(xù)研究。研究發(fā)現(xiàn)ClipR-59同Elmo2相互作用,通過調(diào)節(jié)Rac1的活性進行調(diào)控肌細胞的融合。 首先,免疫共沉淀實驗證實,ClipR-59;和Elmo2在體內(nèi)和體外都是相互作用的,通過免疫熒光實驗發(fā)現(xiàn)ClipR-59和Elmo2在細胞內(nèi)有相同的定位分布。其次,以C2C12細胞為體外研究模型,觀察ClipR-59在肌肉細胞分化過程中的表達。結(jié)果發(fā)現(xiàn),ClipR-59蛋白的表達量逐漸增加,并與分化標記蛋白Myogenin, Myosin Heavy Chain的表達量變化趨勢一致。用表達ClipR-59shRNA的慢病毒感染C2C12細胞,誘導分化結(jié)果顯示,抑制ClipR-59的表達,C2C12細胞的分化也受到抑制；并且抑制ClipR-59的表達不影響分化標記蛋白Myogenin的表達。這說明ClipR-59影響的是肌肉細胞分化后期所發(fā)生的融合過程,而不是早期分化基因的表達。再次,分別對Elmo2和ClipR-59蛋白做一系列去掉不同結(jié)構(gòu)域的突變,通過GST (Glutathione S-transferase)-Pull down實驗證實Elmo2通過PH結(jié)構(gòu)域同ClipR-59相互作用,ClipR-59通過N端的E/P結(jié)構(gòu)域同Elmo2相互作用。通過Co-IP實驗證實ClipR-59, Elmo2和Dock180形成一個異源復合體。通過GST-CRIB(Cdc24/Rac1interactive binding domain of p21activated kinase) pull down實驗證明：過表達Elmo2和ClipR-59將增加Racl活性；在C2C12細胞內(nèi),干涉ClipR-59的表達將抑制Racl的活性。接下來,分別用表達ClipR-59和ΔE/PClipR-59的逆轉(zhuǎn)錄病毒感染C2C12細胞,分化結(jié)果顯示,過表達ClipR-59可以增加C2C12細胞的融合,與對照相比,融合系數(shù)增加約10%;而過表達與Elmo2沒有作用的ΔE/P ClipR-59則抑制C2C12細胞的融合。在表達ClipR-59shRNA的C2C12細胞內(nèi),過表達ClipR-59可以逆轉(zhuǎn)C2C12細胞的融合,而ΔE/P ClipR-59卻達不到這種效果,說明ClipR-59依賴于同Elmo2相互作用調(diào)控肌細胞的融合。最后,通過GST-Pull down實驗證實了Insulin調(diào)控Elmo2同ClipR-59之間的相互作用；用帶P-Tyr抗體的Beads IP Elmo2, Western Blot結(jié)果顯示,Elmo2是一種酪氨酸被磷酸化修飾的蛋白；通過點突變分析得知,主要的磷酸化位點為第713位的酪氨酸。 綜上,我們研究發(fā)現(xiàn)ClipR-59同Elmo2目互作用,通過調(diào)節(jié)Racl的活性進行調(diào)控肌細胞的融合。這項研究發(fā)現(xiàn)為進一步研究ClipR-59在肌肉發(fā)育過程中的作用提供理論依據(jù)。

【關(guān)鍵詞】：
【學位授予單位】：中國農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：Q343
【目錄】：

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