本文選題：光滑球擬酵母　切入點：基因組規(guī)模生物模型　出處：《江南大學(xué)》2017年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：本文以丙酮酸工業(yè)生產(chǎn)菌株Candida glabrata CCTCC M202019為研究模型,在完成全基因組測序、基因組功能注釋和比較基因組學(xué)研究的基礎(chǔ)上,構(gòu)建了基因組規(guī)模代謝網(wǎng)絡(luò)模型(Genome-scale metabolic model,GSMM)、轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)模型(Transcriptional regulatory network,TRN)和工業(yè)微生物輔因子代謝網(wǎng)絡(luò)模型(Genome-scale cofactor metabolic model,GSCMM)。結(jié)合上述基因組規(guī)模生物模型,運用基于約束的優(yōu)化算法,從基因、代謝、轉(zhuǎn)錄、輔因子等層面上解析了C.glabrata的生理特征(如丙酮酸的高產(chǎn)、低致病性相關(guān)的生物安全性等),并發(fā)展了優(yōu)化其生產(chǎn)性能(如丙酮酸、富馬酸等丙酮酸去路中代謝物)的方法。主要研究結(jié)果如下:1.運用二代高通量測序技術(shù),對C.glabrata CCTCC M202019進(jìn)行全基因組測序,其基因組特征包括:12.1 Mbp基因組大小、38.47%GC含量、5345個基因、191個t RNA、6個r RNA和1.15%的重復(fù)序列等。與C.glabrata CBS138進(jìn)行比較基因組分析,發(fā)現(xiàn)雖然兩菌基因組具有高度相似性,但也存在差異如:中心碳代謝(營養(yǎng)物質(zhì)和二羧酸的轉(zhuǎn)運、氧化磷酸化和丙酮酸分解代謝)和黏附性代謝(凝集素蛋白的低復(fù)雜度重復(fù)區(qū)和功能結(jié)構(gòu)域的缺失和變化)。在此基礎(chǔ)上,借助在四種培養(yǎng)基上的丙酮酸發(fā)酵實驗、哥倫比亞血平板上生長實驗、96孔微孔板內(nèi)壁和內(nèi)皮細(xì)胞的黏附實驗,證明了C.glabrata CCTCC M202019比CBS138菌株具有更強的丙酮酸生產(chǎn)能力和更弱的黏附性和細(xì)胞毒性。2.根據(jù)C.glabrata氨基酸序列、文獻(xiàn)挖掘和專業(yè)數(shù)據(jù)庫,構(gòu)建了C.glabrata的GSMM i NX804。模型i NX804包括804個基因、1025個代謝物和1287個生化反應(yīng),分布于細(xì)胞質(zhì)、線粒體、過氧化物酶體、高爾基體、液泡和胞外區(qū)間。利用模型i NX804解析C.glabrata生理特征,發(fā)現(xiàn)C.glabrata具有較窄的碳源底物譜和寬泛的氮源底物譜;在全合成培養(yǎng)基和類血清培養(yǎng)基上的必需基因分別是130個和74個;高效積累丙酮酸的原因是其具有高效的葡萄糖轉(zhuǎn)運系統(tǒng)、3條丙酮酸生物合成途徑(糖酵解、磷酸戊糖途徑和丙酮醛降解),以及丙酮酸分解代謝的弱化。進(jìn)一步對其生產(chǎn)性能進(jìn)行優(yōu)化,包括:(1)雙基因敲除葡萄糖-6-磷酸脫氫酶和轉(zhuǎn)酮醇酶、雙基因敲除D-乳酸脫氫酶和L-乳酸脫氫酶,均能夠促進(jìn)丙酮酸積累;(2)抑制α-酮戊二酸脫氫酶、增加硫胺素含量和線粒體中ATP水平,可提高α-酮戊二酸的產(chǎn)量;(3)富馬酸產(chǎn)量會隨著糖酵解途徑和胞質(zhì)還原路徑的流量而遞增;(4)異源表達(dá)α-乙酰乳酸脫羧酶,有利于增加乙偶姻的產(chǎn)量�；贕SMM i NX804的改造策略已成功驗證或預(yù)測了相關(guān)產(chǎn)品的積累如富馬酸和乙偶姻等。3.利用C.glabrata轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù),整合從頭反向工程(De-novo reverse-engineering)和同源比對的方法,構(gòu)建了C.glabrata基因組規(guī)模轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò),包括145個轉(zhuǎn)錄因子和3239個靶基因間6655種相互作用。該網(wǎng)絡(luò)具有典型的TRN的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)特征,并且在子網(wǎng)絡(luò)功能上具有顯著的網(wǎng)絡(luò)內(nèi)聚性。結(jié)合C.glabrata的GSMM i NX804,從C.glabrata致病性轉(zhuǎn)錄調(diào)控模塊中篩選得到,6種必需代謝物及其相關(guān)的8種酶可作為藥物靶點,并且已經(jīng)在C.glabrata或其他微生物中得到驗證。4.基于14種工業(yè)微生物的GSMMs,通過基因功能再注釋、模型標(biāo)準(zhǔn)化和精細(xì)化、模型代謝漏洞填補,構(gòu)建了工業(yè)微生物的GSCMM icm NX6434,包括:6434個基因、1782個代謝物和6877個反應(yīng)。GSCMM icm NX6434展示了輔因子參與的代謝反應(yīng)的酶學(xué)、細(xì)胞分區(qū)等基本特征,原核和真核微生物的輔因子代謝占基因組的比率分別為12.9%和4.8%,兩者共有的533個反應(yīng)分布在63條代謝途徑中,已驗證的兩者特有的輔因子代謝分別包括,34條代謝途徑中的152個反應(yīng)和20條代謝途徑中的77個反應(yīng)。ATP、NADH、NADPH和乙酰Co A的合成主要來源于12、21、18和15個反應(yīng),可通過30、7、21和29個反應(yīng)進(jìn)行消耗,消耗的輔因子主要參與生物大分子的合成或?qū)崿F(xiàn)不同代謝途徑間的關(guān)聯(lián)。不同輔因子之間的相互轉(zhuǎn)化,包括ATP-NAD、ATP-乙酰Co A、ATP-NADP(H)、Co A-NADH、Co A-NADPH和NAD-NADP,可作為全局性調(diào)控胞內(nèi)輔因子水平和形式的作用靶點。5.基于工業(yè)微生物的GSCMM icm NX6434,解析輔因子對細(xì)胞生長、產(chǎn)物合成和細(xì)胞魯棒性的影響:(1)微生物生長所必需的輔因子代謝,包含2480個基因和2948個生化反應(yīng)。促進(jìn)細(xì)胞生長的36個輔因子靶點中21個已得到驗證,主要通過增加ATP、NAD、NADPH和乙酰Co A的合成,促使輔因子用于必需代謝模塊,避免副產(chǎn)物形成和無效循環(huán),從而促進(jìn)細(xì)胞生長。(2)根據(jù)25種工業(yè)產(chǎn)品對輔因子的需求分析,發(fā)現(xiàn)輔因子通過影響酶活性、底物水平、酶活和底物水平、與其他輔因子對相互作用等四種方式影響目標(biāo)產(chǎn)物的合成。通過調(diào)控輔因子的濃度、形式、平衡性影響碳代謝流的流量和流向,從而促進(jìn)目標(biāo)產(chǎn)物的合成。(3)整合脅迫條件下28組轉(zhuǎn)錄組學(xué)數(shù)據(jù),發(fā)現(xiàn)在酸性、氧化、高溫、高滲脅迫條件下,微生物細(xì)胞內(nèi)ATP、NAD(H)、NADP(H)、乙酰Co A分別發(fā)生顯著變化。而調(diào)控碳代謝流促進(jìn)相應(yīng)的輔因子合成,或促使輔因子用于脅迫響應(yīng)途徑,則可增強工業(yè)微生物的魯棒性。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：江南大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：Q78

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：1634948