本文選題：地衣芽孢桿菌　切入點：γ-聚谷氨酸(γ-PGA)　出處：《華中農(nóng)業(yè)大學》2016年博士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)是革蘭氏陽性細菌,廣泛地應(yīng)用于多個領(lǐng)域:在農(nóng)業(yè)方面,它可以作為一種益生菌和微生物肥料;在生物制造產(chǎn)業(yè),它可以用來生產(chǎn)各種酶、抗生素、乙偶姻、2,3-丁二醇和γ-聚谷氨酸(Poly-γ-glutamic acid,γ-PGA)等產(chǎn)品。γ-PGA是一種多聚氨基酸高分子聚合物,對環(huán)境以及人體無害,能夠作為重金屬吸附劑、保濕劑、肥料吸收促進劑、飼料營養(yǎng)助劑等,廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)、食品、飼料、化妝品、醫(yī)藥和污水處理等領(lǐng)域。本研究中的地衣芽孢桿菌WX-02菌株主要是從應(yīng)城鹽漬土中分離得到的。它在正常條件下可以合成γ-PGA,在高鹽,高溫等脅迫環(huán)境下可以高產(chǎn)γ-PGA。本論文綜合性地分析了地衣芽孢桿菌的基因組、轉(zhuǎn)錄組、生物網(wǎng)絡(luò),并結(jié)合這幾方面系統(tǒng)地研究了其代謝產(chǎn)物γ-PGA的合成調(diào)控及其在鹽脅迫條件下高產(chǎn)的分子機理,取得了以下幾方面研究結(jié)果:(1)完整地解析了地衣芽孢桿菌WX-02菌株的基因組信息,其基因組由長度為4286821 bp的一條環(huán)狀染色體組成,含有4512個蛋白編碼基因,24個rRNA基因及79個tRNA基因,GC含量為46.1%。(2)基于地衣芽孢桿菌WX-02完整的基因組信息,本研究測得了其在非鹽脅迫和鹽脅迫條件下三個時間點的鏈特異性轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù):11th h(不加入6%NaCl);22th h(加入6%NaCl后11h,短期鹽脅迫);33th h(加入6%NaCl后22h,長期鹽脅迫)。基于轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析識別了90個sRNA,1169個反義轉(zhuǎn)錄本(對應(yīng)734個正義鏈基因)及871個操縱子結(jié)構(gòu)。另外,通過DEGseq軟件分析比較了非鹽脅迫和鹽脅迫條件下的差異表達基因(FDR≤0.001,|log2FC|≥1),發(fā)現(xiàn)相對于11th h而言,分別有234和1439個基因在22th h顯著性的上調(diào)和下調(diào)表達;在33th h,分別有229和1427個基因顯著性的上調(diào)和下調(diào)表達。而22th h和33th h只有133個基因的轉(zhuǎn)錄水平發(fā)生顯著性變化。上述結(jié)果表明,在鹽脅迫條件下大部分基因的表達水平都被顯著性抑制,而短期鹽脅迫和長期鹽脅迫條件下的基因表達水平變化并不明顯。差異表達基因中與能量代謝、氨基酸轉(zhuǎn)運等相關(guān)的功能類基因上調(diào)和下調(diào)的數(shù)量基本相當,表明這些基因在鹽脅迫條件下大部分被激活,從而能夠提供足夠的底物和能量來維持細胞生存。鹽脅迫條件下,氨基酸合成相關(guān)基因,特別是與谷氨酸和脯氨酸代謝相關(guān)基因的表達水平都發(fā)生顯著性變化,如gltABC(共同編碼谷氨酸-α-酮戊二酸酰胺轉(zhuǎn)移酶),gltP(谷氨酸轉(zhuǎn)運體)及ycgMNO等都上調(diào)表達了,而gudB(編碼谷氨酸脫氫酶)則下調(diào)表達了,這些基因表達水平的變化都直接或間接地促進了谷氨酸產(chǎn)量的增加,從而使得γ-PGA在鹽脅迫環(huán)境下能夠高產(chǎn)。(3)本研究基于直系同源及結(jié)構(gòu)域映射方法構(gòu)建了地衣芽孢桿菌WX-02全基因組水平的蛋白質(zhì)相互作用(PPI)網(wǎng)絡(luò)。并從蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)特征,功能相似性及轉(zhuǎn)錄水平相關(guān)性三方面對網(wǎng)絡(luò)進行了評估,最終網(wǎng)絡(luò)含有2448個蛋白及15864個PPIs,且具有高度準確性。結(jié)合轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù),我們探究了非鹽脅迫和鹽脅迫條件下PPI網(wǎng)絡(luò)的動態(tài)變化,分別對比分析了三個時間點(11th h,22th h,33th h)對應(yīng)的PPI網(wǎng)絡(luò),發(fā)現(xiàn)非鹽脅迫和鹽脅迫條件下PPI網(wǎng)絡(luò)沒有明顯的變化且基本不受外界環(huán)境影響。另外,通過網(wǎng)絡(luò)識別了267個不同的蛋白復(fù)合體,并注釋出117個未知蛋白的功能。通過分析γ-PGA相關(guān)的子網(wǎng)絡(luò),發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子CcpA與多數(shù)γ-PGA合成及調(diào)控相關(guān)的蛋白具有直接或間接的互作關(guān)系,如PgsB,GltA,GltB,Pro B,ProJ,YcgM及雙信號轉(zhuǎn)導系統(tǒng)Com P-ComA和DegS-DegU。由此推斷CcpA可能在γ-PGA合成及調(diào)控中起到一個非常至關(guān)重要的作用。(4)為進一步研究地衣芽孢桿菌WX-02的基本代謝情況及γ-PGA合成調(diào)控相關(guān)的重要代謝物及路徑,本研究基于地衣芽孢桿菌WX-02的基因組注釋信息及目前已有的代謝信息構(gòu)建得到了其代謝網(wǎng)絡(luò)模型i WX1009,該模型含有1009個基因,1141個代謝物及1761個反應(yīng)。初步得到的代謝網(wǎng)絡(luò)模型通過PM表型芯片實驗進行了校正和評估,i WX1009和表型芯片實驗數(shù)據(jù)具有76.8%的一致性。表明網(wǎng)絡(luò)模型具有高度可靠性,能夠很好地模擬真實的代謝情況。通過iWX1009模型模擬,發(fā)現(xiàn)在LB培養(yǎng)基中地衣芽孢桿菌WX-02含有195個重要基因,且其中149個可以被枯草芽胞桿菌(B.subtilis)168實驗數(shù)據(jù)證實。另外通過優(yōu)化γ-PGA生產(chǎn)相關(guān)的代謝路徑,發(fā)現(xiàn)從網(wǎng)絡(luò)中移除5個反應(yīng)(rxn00800,rxn00097,rxn05164,rxn05299及rxn00047)可以使得γ-PGA的產(chǎn)量最大化。另外通過網(wǎng)絡(luò)模型我們分析推導出了γ-PGA合成的相關(guān)代謝物及代謝路徑。本研究應(yīng)用系統(tǒng)生物學方法探究了調(diào)控γ-PGA合成的潛在因子、代謝物及代謝路徑,初步闡明了γ-PGA的代謝調(diào)控機理,為構(gòu)建γ-PGA高效規(guī)�；a(chǎn)的基因工程菌株奠定了理論基礎(chǔ)。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：華中農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：Q93

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本文編號：1626173