本文選題：蛋白質(zhì)組學(xué)　切入點(diǎn)：金銀花　出處：《浙江大學(xué)》2016年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：藥用植物是人類預(yù)防和治療疾病的重要工具,也是新藥發(fā)現(xiàn)的重要源泉。隨著人類更加重視健康,對(duì)藥用植物的需求越來越大；而野生藥用植物資源瀕臨枯竭,栽培藥材質(zhì)量參差不齊,嚴(yán)重阻礙了中醫(yī)藥的發(fā)展,遲滯了創(chuàng)新中藥的研究。近年來,申請(qǐng)者所在研究組建立的光酶誘導(dǎo)法通過影響藥用植物的代謝途徑,顯著增加藥用植物中有效成分的含量。但由于藥用植物資源分布的特異性、基因組信息不完善等因素,導(dǎo)致藥用植物中活性成分變化的生物學(xué)機(jī)制研究仍處于探索階段。蛋白質(zhì)組學(xué)研究是后基因組時(shí)代的熱點(diǎn),是生命特征具體實(shí)施的重要環(huán)節(jié)。本論文基于蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)分別對(duì)金銀花蛋白質(zhì)表達(dá)譜、闊葉十大功勞組織特異性、長春花和桑葉的光酶誘導(dǎo)機(jī)制進(jìn)行了研究,從蛋白水平初步闡明了四種藥用植物活性成分產(chǎn)生或變化的分子機(jī)制；同時(shí)也為蛋白質(zhì)組學(xué)在藥用植物上的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。本論文的主要研究內(nèi)容和結(jié)果如下：(1)應(yīng)用CPLL技術(shù)和PEG分級(jí)沉淀法對(duì)金銀花蛋白質(zhì)表達(dá)譜進(jìn)行研究。金銀花(Lonicera japonica (Thunb.))是一種常見中藥,具有抗病毒、抗炎、抗氧化等活性。其主要活性成分為綠原酸、黃酮和環(huán)烯醚萜苷類化合物。為了闡明金銀花中活性成分產(chǎn)生的分子機(jī)制,利用label-free蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)對(duì)金銀花的蛋白質(zhì)表達(dá)譜進(jìn)行分析,共鑒定了177個(gè)蛋白其中包括6個(gè)次生代謝相關(guān)蛋白。為了深入挖掘和表征金銀花蛋白質(zhì)表達(dá)譜,應(yīng)用了組合多肽配體庫(CPLL)技術(shù)對(duì)金銀花中低豐度蛋白進(jìn)行富集以及聚乙二醇(PEG)分級(jí)沉淀法去除高豐度蛋白,結(jié)果經(jīng)過CPLL處理后共鑒定到614個(gè)蛋白包括283個(gè)新發(fā)現(xiàn)的蛋白,而經(jīng)PEG處理后共鑒定529個(gè)蛋白包括239個(gè)新發(fā)現(xiàn)的蛋白。這些蛋白大多與氧化戊糖磷酸途徑、信號(hào)傳導(dǎo)、激素代謝和轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān),結(jié)合著兩種技術(shù)共發(fā)現(xiàn)了28個(gè)苯丙素、黃酮以及萜類合成途徑上的次生代謝相關(guān)蛋白。該研究結(jié)果為闡明金銀花中活性成分的生物合成機(jī)制奠定基礎(chǔ)。與非藥用植物櫻花的蛋白質(zhì)組成比較發(fā)現(xiàn)金銀花中萜類合成途徑中的關(guān)鍵酶—-hydroxymethylbutenyl 4-disphosphate合成酶的豐度是櫻花中的十倍,說明在金銀花中次生代謝相關(guān)蛋白與其活性成分的產(chǎn)生有密切的聯(lián)系。此外,本文涉及的CPLL技術(shù)和PEG分級(jí)沉淀法在金銀花中的應(yīng)用為藥用植物中低豐度蛋白的研究提供了一種新方法。(2)應(yīng)用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)對(duì)闊葉十大功勞葉、莖、根三部位特異性進(jìn)行研究闊葉十大功勞(Mahonia bealei (Fort.))為小檗科十大功勞屬常綠植物,現(xiàn)代研究表明,十大功勞具有抗菌消炎、抗病毒及降血壓等多種生物活性。其主要活性成分非洲防己堿、藥根堿、巴馬汀、粉防己堿和小檗堿等生物堿在根中的含量明顯高于葉和莖。本文應(yīng)用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)對(duì)闊葉十大功勞三部位總蛋白進(jìn)行分析,分別在葉、莖和根中鑒定了304,314和182個(gè)蛋白。其中,與生物堿合成途徑中的關(guān)鍵蛋白S-adenosylmethionine synthetase和(S)-tetrahydroprotoberberine oxidase僅在根中發(fā)現(xiàn),這可能是根部生物堿含量較高的原因。通過對(duì)三部位蛋白質(zhì)組成的比較,發(fā)現(xiàn)十大功勞根中calreticulin蛋白的豐度明顯高于葉和莖,這些結(jié)果顯示具有轉(zhuǎn)運(yùn)功能的calreticulin蛋白則很可能負(fù)責(zé)將生物堿等活性成分從根部轉(zhuǎn)運(yùn)至其他組織部位導(dǎo)致其組織間的差異性。該研究首次在蛋白水平揭示闊葉十大功勞不同部位活性成分含量差異的分子機(jī)制。(3)應(yīng)用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)研究長春花光酶誘導(dǎo)機(jī)制長春花(Catharanthus roseus)為夾竹桃科長春花屬植物,全草入藥,長春花植株中所含的生物堿具有多種藥理活性。申請(qǐng)者所在研究組前期研究發(fā)現(xiàn)光酶誘導(dǎo)后長春花葉片中的吲哚類生物堿含量明顯增加。為了探索光酶誘導(dǎo)對(duì)長春花中吲哚生物堿合成的影響,本文應(yīng)用了label-free蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)對(duì)光酶誘導(dǎo)前后長春花植株葉片總蛋白進(jìn)行分析比較,結(jié)果共鑒定了87個(gè)差異蛋白,其中21個(gè)表達(dá)下調(diào),66個(gè)表達(dá)上調(diào)。此外,光酶誘導(dǎo)后三羧酸循環(huán)和細(xì)胞壁相關(guān)蛋白的豐度顯著升高,而四吡咯合成以及光合作用相關(guān)蛋白的豐度降低。其中光酶誘導(dǎo)后吲哚生物堿生物合成途徑中的關(guān)鍵酶10-hydroxygeraniol oxidoreductase (10-hgo)的豐度是對(duì)照組中的兩倍。結(jié)合熒光定量PCR技術(shù)對(duì)光酶誘導(dǎo)期間長春花葉片中包括10hgo基因在內(nèi)的吲哚生物堿合成途徑上關(guān)鍵基因進(jìn)行表達(dá)分析驗(yàn)證,結(jié)果表明光酶誘導(dǎo)顯著影響長春花植株的光合作用,而其通過提高體內(nèi)生物堿的合成來適應(yīng)光酶誘導(dǎo)。該研究闡明了長春花植株中活性成分生物堿含量增加的分子機(jī)制,為光酶誘導(dǎo)法的運(yùn)用提供了理論依據(jù)。(4)應(yīng)用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)研究光酶誘導(dǎo)桑葉中Diels-Alder加合物生物合成機(jī)制桑(Morus alba L.)是重要的藥食同源藥用植物,其干燥的根皮中含有微量具有抗炎、抗腫瘤和抗病毒等生物活性的Diels-Alder型加合物。本文利用光酶誘導(dǎo)法誘導(dǎo)新鮮桑葉產(chǎn)生大量Diels-Alder型加合物及其前體物,并對(duì)該類化合物進(jìn)行分離、結(jié)構(gòu)鑒定以及定量分析,共從光酶誘導(dǎo)的桑葉中分離得到9個(gè)化合物：綠原酸、異槲皮苷、木犀草素-7-O-葡萄糖苷、桑辛素M、桑辛素C、桑辛素N、Morachalcone、Chalcomoracin和Guangsangon E。此外,分別對(duì)對(duì)照組、UV-B組、UV-B聯(lián)合暗培養(yǎng)組桑葉進(jìn)行差異蛋白質(zhì)組學(xué)分析,結(jié)果在UV-B組中共鑒定了123個(gè)差異蛋白,其中107個(gè)表達(dá)上調(diào),16個(gè)表達(dá)下調(diào)；而UV-B聯(lián)合暗培養(yǎng)組中共鑒定了169個(gè)差異蛋白,其中40個(gè)表達(dá)上調(diào),129個(gè)表達(dá)下調(diào)。通過對(duì)Diels-Alder加合物合成途徑中關(guān)鍵基因的表達(dá)分析以及Diels-Alder合酶的酶活驗(yàn)證,首次揭示了光酶誘導(dǎo)桑葉中Diels-Alder型加合物生物合成的機(jī)制。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：Q946

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：1604081