發(fā)布時(shí)間：2018-03-12 22:35

  本文選題：小鼠胚胎干細(xì)胞　切入點(diǎn)：小鼠成纖維細(xì)胞　出處：《暨南大學(xué)》2016年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：雄激素主要由睪丸間質(zhì)細(xì)胞(leydig Cell,LC)合成和分泌的。雄激素缺乏會(huì)導(dǎo)致男性外生殖器畸形、第一和第二性征發(fā)育遲緩、少精或無(wú)精癥及性功能障礙等疾病,嚴(yán)重影響人類的生活質(zhì)量和生殖健康。近年來(lái),由于先天性疾病、環(huán)境污染、工作壓力日益增大以及人口老齡化等原因?qū)е虏G丸間質(zhì)細(xì)胞功能障礙,進(jìn)而誘發(fā)雄激素缺乏相關(guān)疾病呈逐年上升的趨勢(shì),并已成為當(dāng)前受到普遍關(guān)注的社會(huì)問(wèn)題。盡管臨床上可通過(guò)補(bǔ)充雄性激素進(jìn)行替代治療,但使用者容易出現(xiàn)情緒不穩(wěn)、肝功能損害、高血脂等并發(fā)癥及誘發(fā)前列腺癌等風(fēng)險(xiǎn),因而大大限制其廣泛應(yīng)用。為此,本研究利用轉(zhuǎn)錄因子誘導(dǎo)胚胎干細(xì)胞和成體細(xì)胞分化為具雄激素合成分泌功能的類Leydig細(xì)胞,為治療男性雄激素缺乏癥提供新方法。在小鼠胚胎干細(xì)胞定向分化為類Leydig細(xì)胞方面,本研究首先利用小分子化合物8-溴-環(huán)腺苷酸(8-Br-cAMP)和毛猴素(FSK)在體外將過(guò)表達(dá)類固醇生成因子(SF-1)的小鼠胚胎干細(xì)胞(mESC-SF-1)定向誘導(dǎo)分化為未成熟Leydig細(xì)胞。然后,再將這些細(xì)胞移植至EDS造模“敲除”內(nèi)源性Leydig細(xì)胞的大鼠睪丸內(nèi),利用睪丸內(nèi)環(huán)境促進(jìn)其發(fā)育為成熟Leydig細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,8-溴-環(huán)腺苷酸(8-Br-cAMP)和毛猴素(FSK)聯(lián)合使用可以顯著提高mESC-SF-1定向分化為L(zhǎng)eydig前體細(xì)胞的效率,并促進(jìn)這些前體細(xì)胞表達(dá)雄激素合成通路中的關(guān)鍵酶(St AR、CYP11A1、HSD3B1、CYP17A1和INSL3)和合成雄激素。將這些Leydig前體細(xì)胞移植至雄激素缺乏的大鼠睪丸內(nèi),其能進(jìn)一步發(fā)育為成熟的類Leydig細(xì)胞,促進(jìn)雄激素缺乏大鼠血清睪酮含量恢復(fù)到正常水平。為了規(guī)避干細(xì)胞引起的倫理問(wèn)題,本研究利用生物信息學(xué)分析了參與Leydig細(xì)胞譜系發(fā)育的轉(zhuǎn)錄因子,篩選出11個(gè)可能調(diào)控成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為L(zhǎng)eydig細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄因子并克隆至慢病毒載體中。將篩選獲得的轉(zhuǎn)錄因子分成不同的組合,分別感染穩(wěn)定表達(dá)CYP11A1-promoter-mCherry的胚胎成纖維細(xì)胞,再利用流式分析細(xì)胞術(shù)以及酶聯(lián)免疫方法分析不同組合誘導(dǎo)CYP11A1陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞的比例及其表達(dá)雄激素的能力,最后獲得最佳誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)分化成具雄激素合成功能的類Leydig細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄因子組合Dmrt1、Gata4和Nr5a1(簡(jiǎn)稱DGN)。這3個(gè)因子組合可誘導(dǎo)小鼠成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為類Leydig細(xì)胞,表達(dá)Leydig細(xì)胞特異蛋白及合成睪酮。將其移植至雄激素低下模型鼠睪丸中,可恢復(fù)模型鼠血清睪酮含量至正常水平。轉(zhuǎn)分化前后細(xì)胞增殖及表達(dá)譜分析結(jié)果表明,DGN組合介導(dǎo)的轉(zhuǎn)分化過(guò)程并不依賴有絲分裂,而是通過(guò)上調(diào)甲基化調(diào)控基因Gadd45a的表達(dá)量進(jìn)而降低細(xì)胞基因組DNA甲基化水平來(lái)實(shí)現(xiàn)的。此外,DGN組合同樣可以誘導(dǎo)終末端分化的成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為具雄激素合成功能的類Leydig細(xì)胞。本研究利用誘導(dǎo)干細(xì)胞定向分化及成體細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為具雄激素合成分泌功能的類Leydig細(xì)胞,為男性不育和性功能低下等生殖系統(tǒng)疾病的藥物開(kāi)發(fā)及分子機(jī)制研究提供細(xì)胞模型和理論基礎(chǔ),促進(jìn)個(gè)體化細(xì)胞治療的進(jìn)一步發(fā)展。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：暨南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R329.2

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本文編號(hào)：1603563