本文選題：耐甲氧西林金黃色葡萄球菌　切入點(diǎn)：烈性噬菌體　出處：《吉林大學(xué)》2016年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：金黃色葡萄球菌(Staphyloccocus aureus)是一種人畜共患病的重要病原菌,可引起全身和局部性的感染性疾病。耐藥菌株特別是耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(methicilin-resistant S.aureus,MRSA)的出現(xiàn),極大的增加了細(xì)菌感染性疾病治療的難度。噬菌體(bacteriophage)是一種以細(xì)菌為宿主,可以感染和裂解細(xì)菌的病毒,以其獨(dú)特的作用機(jī)制能夠快速殺滅特定病原菌,使其在耐藥細(xì)菌感染治療方面具有很大應(yīng)用潛力。本研究以金黃色葡萄球菌的噬菌體GH15裂解系統(tǒng)作為研究對象,在本課題組揭示的裂解酶結(jié)構(gòu)功能的基礎(chǔ)上,系統(tǒng)研究噬菌體GH15穿孔素(Hol GH15)。確定穿孔素Hol GH15基因、重組Hol GH15的表達(dá)、生物學(xué)活性、作用機(jī)制及其應(yīng)用研究,同時(shí)探索噬菌體GH15、裂解酶對MRSA生物被膜的作用。為應(yīng)用噬菌體裂解系統(tǒng)防控金黃色葡萄球菌感染奠定理論基礎(chǔ)。首先通過序列比對和生物信息學(xué)分析預(yù)測噬菌體GH15的穿孔素基因,確定噬菌體GH15穿孔素基因(Hol GH15)位于噬菌體裂解模塊中,并且與裂解酶基因(Lys GH15)相鄰。Hol GH15為具有兩個(gè)跨膜區(qū)的膜蛋白,其N-端和C-端都分布于細(xì)胞質(zhì)內(nèi),具有II類穿孔素特征。Hol GH15的13~95位氨基酸與噬菌體穿孔素蛋白家族Phage_holin_1家族成員具有很高的同源性,屬于Phage_holin_1超家族。同時(shí),Hol GH15與已經(jīng)公布預(yù)測可能為革蘭氏陽性菌(金黃色葡萄球菌,發(fā)酵乳桿菌和鏈球菌)噬菌體holin進(jìn)行比對,Hol GH15僅與金黃色葡萄球菌噬菌體K穿孔素同源性最高(95%),其它低于60%。為了進(jìn)一步研究穿孔素基因(Hol GH15)的功能,對其進(jìn)行了原核表達(dá)。在表達(dá)過程中發(fā)現(xiàn),表達(dá)的Hol GH15能夠抑制宿主菌生長。通過檢測Hol GH15對能量毒素敏感性和亞細(xì)胞定位特征,確認(rèn)了Hol GH15基因具有編碼穿孔素的功能。構(gòu)建跨膜區(qū)(transmembrane domain,TMD)缺失Hol GH15-TMD1(-)和Hol GH15-TMD2(-),證明TMD是Hol GH15發(fā)揮生物學(xué)活性所必須的。重組Hol GH15蛋白具有胞外抑菌功能,其最佳作用溫度37℃,最適p H值5.2。抑菌實(shí)驗(yàn)表明,Hol GH15不但能夠抑制金黃色葡萄球菌生長,還能抑制銅綠假單胞菌、肺炎克雷伯菌、枯草芽孢桿菌和大腸桿菌的生長,對李斯特菌表現(xiàn)為殺菌活性。發(fā)現(xiàn)Hol GH15不具有溶血功能,可通過改變細(xì)菌細(xì)胞膜通透性發(fā)揮抑菌和殺菌活性。由于MRSA形成生物膜在持續(xù)性感染中起著重要作用,噬菌體GH15及裂解酶Lys GH15對MRSA表現(xiàn)出廣譜、高效的裂解活性。因而,進(jìn)一步探討噬菌體GH15及Lys GH15對生物被膜的作用。本研究采用24孔板法培養(yǎng)生物被膜,其中17株(17/28)形成生物被膜的能力較強(qiáng)。分別用噬菌體GH15和Lys GH15處理生物被膜,發(fā)現(xiàn)噬菌體GH15和Lys GH15都可以清除形成的生物被膜,噬菌體GH15還能抑制生物被膜的形成。噬菌體GH15在非離子清潔劑、10 mmol EDTA、蒸餾水和10%血清中活性穩(wěn)定,與1%Triton X-100聯(lián)合應(yīng)用清除生物被膜能力更強(qiáng)。Lys GH15可以在10μg/m L 1 h內(nèi)殺滅幾乎所有的MRSA生物被膜菌,并將其清除。由于β-內(nèi)酰胺類抗生素能夠抑制細(xì)菌細(xì)胞壁的形成,Hol GH15作用于細(xì)菌細(xì)胞膜,二者具有協(xié)同抗菌能力,聯(lián)合應(yīng)用抗菌能力增強(qiáng)。Hol GH15還能夠在低溫(4℃)條件下抑制李斯特菌的生長,具有一定的應(yīng)用價(jià)值。綜上所述,噬菌體GH15、裂解酶和穿孔素能夠在防治金黃色葡萄球菌及其生物被膜,控制李斯特菌方面具有一定的應(yīng)用價(jià)值,可作為新型抗菌劑治療相關(guān)感染。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S852.61

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本文編號：1599081