本文選題：紅莧菜　切入點(diǎn)：甜菜素　出處：《中國農(nóng)業(yè)大學(xué)》2016年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：甜菜素是一組水溶性的含氮色素,包括甜菜紅素和甜菜黃素。它主要位于石竹目植物中,替代了花青素,賦予這些植物五彩繽紛的艷麗色彩,并且廣泛應(yīng)用于食品、藥品等行業(yè)。一般認(rèn)為甜菜素生物合成途徑起始于L-酪氨酸的羥基化。盡管PPO型酪氨酸酶被認(rèn)為是參與此步反應(yīng)的酶,但是目前仍然存在爭論。本研究試圖分離純化能夠羥基化酪氨酸的酶并且克隆其基因來解析甜菜素生物合成途徑中的起始步驟。從甜菜素植物——紅莧菜的葉片中通過切膠回收法分離純化到一個(gè)電泳純的酶。SDS-PAGE和Native PAGE分析揭示純化的酶是一個(gè)三亞基蛋白,亞基分子量約為58 kDa。體外催化實(shí)驗(yàn)證明該酶既具有過氧化氫酶活性,又具有單酚酶活性(L-酪氨酸為底物)和雙酚酶活性(L-DOPA為底物)。這三個(gè)酶活性各自的最適溫度、最適pH和Km值不同：過氧化氫酶活性(20℃、pH 7.0和188mM)、單酚酶活性(60℃、pH 8.0和0.2 mM)和雙酚酶活性(60℃、pH 8.0和0.6 mM。體外抑制分析揭示該酶的過氧化氫酶活性和酚氧化酶活性都可以分別被經(jīng)典的過氧化氫酶抑制劑和經(jīng)典的酪氨酸酶抑制劑(托酚酮除外)抑制。采用nano-LC-MS/MS對(duì)純化的酶進(jìn)行分析,得到5個(gè)置信度高的肽段。MASCOT分析證明這5個(gè)肽段序列都指向植物過氧化氫酶,其中包括兩種甜菜素植物——冰葉日中花和鹽地堿蓬的過氧化氫酶。參考上述甜菜素植物的過氧化氫酶基因序列設(shè)計(jì)兼并引物,通過RT-PCR和RACE克隆到一段1951 bp的cDNA序列,它包括一條編碼492個(gè)氨基酸的完整的CDS。根據(jù)RACE cDNA序列,克隆了完整的CDS序列,兩者編碼的氨基酸序列完全相同。序列分析結(jié)果揭示：該CDS編碼的多肽鏈中不但含有nano-LC-MS/MS分析得到的全部肽段序列,而且含有過氧化氫酶活性中心和酚氧化酶活性中心,因此將該酶命名為AcCATPO.將AcCATPO及己知的CATPOs的氨基酸序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中搜集到的植物過氧化氫酶序列進(jìn)行比對(duì)分析后發(fā)現(xiàn)：這兩個(gè)活性中心同樣也存在于非甜菜素植物的過氧化氫酶中,這說明第四組過氧化氫酶在植物中普遍存在。為了初步驗(yàn)證AcCATPO在甜菜素生物合成途徑中的作用,對(duì)普通莧菜葉片中綠色部分和紅色部分的甜菜素含量與AcCATPO的mRNA表達(dá)水平的關(guān)系進(jìn)行考查,觀察到葉片綠色部分和紅色部分中AcCATPO的轉(zhuǎn)錄物豐度與甜菜黃素對(duì)甜菜紅素的比率之間呈正相關(guān),這暗示AcCATPO可能主要參與甜菜黃素的生物合成途徑。以上結(jié)果表明：第四組過氧化氫酶,即過氧化氫酶-酚氧化酶,也普遍存在于植物中,并且有可能參與了甜菜素植物中甜菜素生物合成途徑中酪氨酸的羥基化。在植物中,第四組過氧化氫酶的成功鑒定為研究這類酶在植物體內(nèi)的功能,尤其在甜菜素生物合成途徑中的功能打開了一個(gè)窗口。
[Abstract]:Betaine is a group of water-soluble nitrogen-containing pigments, including betaine and berelin. It is located mainly in carnation plants, replaces anthocyanin, gives these plants colorful colors, and is widely used in foods. Industries such as pharmaceuticals. The betaine biosynthesis pathway is generally thought to originate from the hydroxylation of L-tyrosine. Although PPO tyrosinase is thought to be the enzyme involved in this reaction, However, there is still controversy. This study attempts to isolate and purify the enzyme that can hydroxylate tyrosine and clone its gene to elucidate the initial steps in the biosynthesis pathway of betaine. A pure enzyme, SDS-PAGE, and Native PAGE analysis showed that the purified enzyme was a three subunit protein. The molecular weight of the subunit was about 58 kDa.The catalytic experiments in vitro showed that the enzyme had both catalase activity and monophenolase activity (L- tyrosine as substrate) and bisphenol enzyme activity (L-DOPA) as substrate. The optimum pH value and km value are different: catalase activity is 20 鈩，

本文編號(hào)：1591845