本文選題：β-葡萄糖苷酶　切入點：β-半乳糖苷酶　出處：《安徽大學》2017年博士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：嗜熱微生物是一種生活在高溫環(huán)境中的微生物,在探討生物進化、高溫適應機制和嗜熱酶資源的挖掘方面都具有重要的意義。隨著基因組測序技術的進步,很多嗜熱微生物的全基因組被測序,這為挖掘新型酶資源提供了很好的資源。黃熱厭氧芽孢桿菌(Anoxybacillus favithermussubsp.yunnaensis)E13T最適生長溫度為55℃,2014年其基因組測序完成。本課題對該菌株的糖苷酶進行了分析,篩選出三個未被報道且與已知同源性酶相似性較低(不超過60%)的糖苷水解酶進行克隆表達和酶學研究。這三個酶為β-葡萄糖苷酶(β-glucosidase,EC 3.2.1.21,BglP)、β-半乳糖苷酶(β-galactosidase,EC.3.2.1.23,BgalP)和 α-半乳糖苷酶(α-galactosidase,EC3.2.1.22,AgalP)。β-葡萄糖苷酶BglP克隆在表達載體pET22b上,在大腸桿菌中獲得了可溶性表達,純化后的蛋白分子量為52kDa,與理論分子量一致。酶學性質(zhì)結果顯示,BglP的最適溫度為60Κ,最適pH為7.0。BglP的熱穩(wěn)定性很好,60℃的半衰期長達10 h。它在中性和弱堿環(huán)境(pH 7.0-8.5)中也非常穩(wěn)定。BglP在以對硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷(pNPG)為底物時的比活為 842±15.5U/mg,Km為0.29±0.0mM,Vmax為771±39μmol/min.mg。以纖維二糖為底物時,BglP的Km和Vmax分別為12.3±0.8mM和107±5.6μmol/min.mg,這表明BglP是一個催化效率很高的酶。值得注意的是,BglP是一個比較少見的葡萄糖和木糖激活酶。當葡萄糖和木糖的濃度分別高于2.2 M和1.4 M時,BglP的活力才出現(xiàn)抑制效應,而在這個濃度以內(nèi),BglP的活力被顯著的提高,最高時分別為無添加時的2.6倍(葡萄糖激活)和1.8倍(木糖激活)。葡萄糖不僅能提高BglP的酶活,還能顯著提高BglP的溫度穩(wěn)定性。這些性質(zhì)綜合表明BglP是一個具有優(yōu)良潛力的新型β-葡萄糖苷酶。BglP在最優(yōu)條件下對大豆苷水解率為98.5%,對染料木苷水解率為96.8%,展示出其在大豆異黃酮產(chǎn)業(yè)中的良好應用潛力。BglP在纖維素降解方面也具有明顯的應用優(yōu)勢,以Celluclast 1.5L降解甘蔗渣為例,BglP可以提高轉(zhuǎn)化率1.9倍。當反應體系中存在高濃度葡萄糖(500mM)或木糖(200mM)時,BglP可以分別提高3.4和3.0倍的轉(zhuǎn)化率。β-半乳糖苷酶BgalP克隆在表達載體PET32a上,在大腸桿菌中獲得了可溶性表達,純化后的蛋白分子量為76 kDa,與理論分子量一致。酶學性質(zhì)結果顯示BgalP反應的最適溫度為55℃,最適pH為6.5。BgalP的熱穩(wěn)定性很好,65℃的半衰期為8h。在以oNPG為底物時,比酶活為188 U/mg,優(yōu)于同家族中其他細菌來源的β-半乳糖苷酶。此外,BgalP對常見的有機溶劑具有很好的耐受能力,而目前的研究中,對于耐有機溶劑性質(zhì)的β-半乳糖苷酶鮮見報道,因此該β-半乳糖苷酶可以應用在含有機溶劑環(huán)境下的工業(yè)催化領域。αα-半乳糖苷酶AgalP克隆在表達載體pET32a上,純化后的蛋白分子量為86 kDa,但是是包涵體。采用鎳柱復性法對AgalP包涵體蛋白進行了復性,復性率為25%。酶學性質(zhì)結果顯示,AgalP的最適反應溫度為65℃,熱穩(wěn)定性好,65℃下的半衰期達到5.5 h。最適反應pH為7.0,在pH 5-10的范圍可保持較好的酸堿穩(wěn)定性。在以pNPGal為底物時,比酶活為22 U/mg,Km值為0.143 mM,Vmax為5.2μmol/min.mg。與同類酶比較后,結果顯示該酶的活性水平較低。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：安徽大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：Q78;Q936

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本文編號：1586261