本文選題：β-葡萄糖苷酶　切入點(diǎn)：β-半乳糖苷酶　出處：《安徽大學(xué)》2017年博士論文　論文類(lèi)型：學(xué)位論文

【摘要】：嗜熱微生物是一種生活在高溫環(huán)境中的微生物,在探討生物進(jìn)化、高溫適應(yīng)機(jī)制和嗜熱酶資源的挖掘方面都具有重要的意義。隨著基因組測(cè)序技術(shù)的進(jìn)步,很多嗜熱微生物的全基因組被測(cè)序,這為挖掘新型酶資源提供了很好的資源。黃熱厭氧芽孢桿菌(Anoxybacillus favithermussubsp.yunnaensis)E13T最適生長(zhǎng)溫度為55℃,2014年其基因組測(cè)序完成。本課題對(duì)該菌株的糖苷酶進(jìn)行了分析,篩選出三個(gè)未被報(bào)道且與已知同源性酶相似性較低(不超過(guò)60%)的糖苷水解酶進(jìn)行克隆表達(dá)和酶學(xué)研究。這三個(gè)酶為β-葡萄糖苷酶(β-glucosidase,EC 3.2.1.21,BglP)、β-半乳糖苷酶(β-galactosidase,EC.3.2.1.23,BgalP)和 α-半乳糖苷酶(α-galactosidase,EC3.2.1.22,AgalP)。β-葡萄糖苷酶BglP克隆在表達(dá)載體pET22b上,在大腸桿菌中獲得了可溶性表達(dá),純化后的蛋白分子量為52kDa,與理論分子量一致。酶學(xué)性質(zhì)結(jié)果顯示,BglP的最適溫度為60Κ,最適pH為7.0。BglP的熱穩(wěn)定性很好,60℃的半衰期長(zhǎng)達(dá)10 h。它在中性和弱堿環(huán)境(pH 7.0-8.5)中也非常穩(wěn)定。BglP在以對(duì)硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷(pNPG)為底物時(shí)的比活為 842±15.5U/mg,Km為0.29±0.0mM,Vmax為771±39μmol/min.mg。以纖維二糖為底物時(shí),BglP的Km和Vmax分別為12.3±0.8mM和107±5.6μmol/min.mg,這表明BglP是一個(gè)催化效率很高的酶。值得注意的是,BglP是一個(gè)比較少見(jiàn)的葡萄糖和木糖激活酶。當(dāng)葡萄糖和木糖的濃度分別高于2.2 M和1.4 M時(shí),BglP的活力才出現(xiàn)抑制效應(yīng),而在這個(gè)濃度以內(nèi),BglP的活力被顯著的提高,最高時(shí)分別為無(wú)添加時(shí)的2.6倍(葡萄糖激活)和1.8倍(木糖激活)。葡萄糖不僅能提高BglP的酶活,還能顯著提高BglP的溫度穩(wěn)定性。這些性質(zhì)綜合表明BglP是一個(gè)具有優(yōu)良潛力的新型β-葡萄糖苷酶。BglP在最優(yōu)條件下對(duì)大豆苷水解率為98.5%,對(duì)染料木苷水解率為96.8%,展示出其在大豆異黃酮產(chǎn)業(yè)中的良好應(yīng)用潛力。BglP在纖維素降解方面也具有明顯的應(yīng)用優(yōu)勢(shì),以Celluclast 1.5L降解甘蔗渣為例,BglP可以提高轉(zhuǎn)化率1.9倍。當(dāng)反應(yīng)體系中存在高濃度葡萄糖(500mM)或木糖(200mM)時(shí),BglP可以分別提高3.4和3.0倍的轉(zhuǎn)化率。β-半乳糖苷酶BgalP克隆在表達(dá)載體PET32a上,在大腸桿菌中獲得了可溶性表達(dá),純化后的蛋白分子量為76 kDa,與理論分子量一致。酶學(xué)性質(zhì)結(jié)果顯示BgalP反應(yīng)的最適溫度為55℃,最適pH為6.5。BgalP的熱穩(wěn)定性很好,65℃的半衰期為8h。在以oNPG為底物時(shí),比酶活為188 U/mg,優(yōu)于同家族中其他細(xì)菌來(lái)源的β-半乳糖苷酶。此外,BgalP對(duì)常見(jiàn)的有機(jī)溶劑具有很好的耐受能力,而目前的研究中,對(duì)于耐有機(jī)溶劑性質(zhì)的β-半乳糖苷酶鮮見(jiàn)報(bào)道,因此該β-半乳糖苷酶可以應(yīng)用在含有機(jī)溶劑環(huán)境下的工業(yè)催化領(lǐng)域。αα-半乳糖苷酶AgalP克隆在表達(dá)載體pET32a上,純化后的蛋白分子量為86 kDa,但是是包涵體。采用鎳柱復(fù)性法對(duì)AgalP包涵體蛋白進(jìn)行了復(fù)性,復(fù)性率為25%。酶學(xué)性質(zhì)結(jié)果顯示,AgalP的最適反應(yīng)溫度為65℃,熱穩(wěn)定性好,65℃下的半衰期達(dá)到5.5 h。最適反應(yīng)pH為7.0,在pH 5-10的范圍可保持較好的酸堿穩(wěn)定性。在以pNPGal為底物時(shí),比酶活為22 U/mg,Km值為0.143 mM,Vmax為5.2μmol/min.mg。與同類(lèi)酶比較后,結(jié)果顯示該酶的活性水平較低。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：安徽大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類(lèi)號(hào)】：Q78;Q936

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本文編號(hào)：1586261