本文關(guān)鍵詞：高分辨率熔解曲線（HRM）技術(shù)在動(dòng)物病毒基因分型中的研究及應(yīng)用，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

《吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)》 2015年

犬細(xì)小病毒VP2基因的原核表達(dá)及鑒定

張馨穎  

【摘要】：犬細(xì)小病毒(CPV)VP2蛋白是CPV的主要結(jié)構(gòu)蛋白,大約占衣殼蛋白的90%,編碼病毒主要的抗原決定簇。它既是主要免疫保護(hù)性蛋白,又是良好的診斷抗原。因此,VP2基因的表達(dá)及鑒定,不僅為建立犬細(xì)小病毒血清抗體檢測(cè)方法提供了診斷抗原材料,也為長(zhǎng)春市犬細(xì)小病毒流行株的研究提供了資料。本研究以長(zhǎng)春某動(dòng)物醫(yī)院臨床疑似病犬的糞便為樣品,根據(jù)GenBank中收錄的CPV-VP2基因序列設(shè)計(jì)了一對(duì)特異性引物,擴(kuò)增出大小為1790bp的基因片段。將此片段克隆至pMD18-T載體上,獲得重組克隆載體pMD18-T-VP2,經(jīng)雙酶切鑒定及測(cè)序,其同源性和遺傳進(jìn)化分析結(jié)果表明,此基因片段與GenBank中收錄的10個(gè)不同國(guó)家的CPV-VP2基因的核苷酸同源性為99.2%~99.9%,氨基酸同源性為99.0%~99.8%,由此確定此基因是CPV-VP2基因。其中與一株新CPV-2a型毒株GQ379042.1親緣性最高,只有一個(gè)堿基不同,因此確定該基因?qū)儆谛翪PV-2a型,并申請(qǐng)GenBank登錄號(hào)KP686093。再將重組克隆載體上的VP2基因亞克隆至原核表達(dá)載體pET-32a上,得到的重組表達(dá)載體pET-32a-VP2,經(jīng)雙酶切鑒定、PCR鑒定及測(cè)序,表明VP2基因已經(jīng)成功克隆至pET-32a載體上,且閱讀框正確,無(wú)移碼突變。因此,成功構(gòu)建了原核重組表達(dá)載體pET-32a-VP2。將鑒定正確的原核重組表達(dá)載體pET-32a-VP2轉(zhuǎn)化E.coliBL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞誘導(dǎo)表達(dá)。結(jié)果表明:在87kD左右出現(xiàn)明顯的目的蛋白條帶,且以包涵體形式表達(dá);對(duì)誘導(dǎo)條件進(jìn)行優(yōu)化發(fā)現(xiàn),當(dāng)IPTG濃度為2mM、誘導(dǎo)時(shí)間為4h、誘導(dǎo)溫度為37℃時(shí),蛋白的表達(dá)量最大;鎳柱純化后,經(jīng)蛋白免疫印跡試驗(yàn)(Western blotting)鑒定,證明VP2蛋白具有反應(yīng)原性。

【關(guān)鍵詞】：
【學(xué)位授予單位】：吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：S852.655
【目錄】：

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【共引文獻(xiàn)】

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