本文關(guān)鍵詞：鼠可溶性鳥苷酸環(huán)化酶β_1亞基片段中半胱氨酸功能研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

《吉林大學(xué)》 2015年

鼠可溶性鳥苷酸環(huán)化酶β_1亞基片段中半胱氨酸功能研究

劉麗  

【摘要】：可溶性鳥苷酸環(huán)化酶(sGC)是含卟啉蛋白，它作為人體內(nèi)最主要的NO受體，結(jié)合NO從而活性提高數(shù)百倍，催化GTP生成第二信使cGMP，調(diào)節(jié)諸多生理功能，比如平滑肌舒張，神經(jīng)傳遞，抗血小板凝聚等。sGC是異源二聚體，由α和β兩個亞基組成，其中β亞基中結(jié)合有一個卟啉。β亞基N末端的194個氨基酸是組成能夠結(jié)合卟啉的最小片段，與全酶的配基結(jié)合性質(zhì)相似，是H-NOX結(jié)構(gòu)域家族一員。這個結(jié)構(gòu)域經(jīng)常被當(dāng)做模型研究sGC的卟啉環(huán)境和配基結(jié)合特征。一直以來，卟啉一直被認(rèn)為是NO的唯一結(jié)合位點，但最近的研究表明，sGC的半胱氨酸也參與了與NO的反應(yīng)調(diào)節(jié)酶的活性。這一發(fā)現(xiàn)對了解sGC激活機制，活性調(diào)節(jié)機制以及相應(yīng)藥物的研發(fā)有很重要的意義。 在本論文中，我們構(gòu)建了sGC β1亞基的表達(dá)體系，利用大腸桿菌分別表達(dá)了鼠可溶性鳥苷酸環(huán)化酶的β1亞基，sGC β1(1-385)和sGC β1(1-194)并對相應(yīng)的蛋白進(jìn)行了純化和譜學(xué)表征。同時我們將研究的重點放在了蛋白中的半胱氨酸。在sGC β1(1-194)片段蛋白中含有三個半胱氨酸，分別位于78，122和174位，其中78位的半胱氨酸距離卟啉中的鐵只有6左右的距離。我們的結(jié)果證明β亞基上的78位半胱氨酸（C78）對卟啉的結(jié)合穩(wěn)定性以及酶活都有重要影響。 為了研究C78對卟啉穩(wěn)定性的影響，我們以sGC β1(1-194)為模型，利用分子生物學(xué)技術(shù)，用帶有不同性質(zhì)側(cè)鏈的氨基酸對78位半胱氨酸進(jìn)行了替換得到了關(guān)于C78的一系列突變體。利用紫外可見吸收光譜，我們證明了78位氨基酸的極性和長度都不同程度的影響卟啉的穩(wěn)定性。隨著非極性側(cè)鏈長度的降低(C78M， C78I和C78A)或者極性側(cè)鏈長度的增加(C78S，C78T，C78E和C78Y)卟啉穩(wěn)定性下降。同時我們對這一系列突變體的光譜性質(zhì)進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)它們的還原態(tài)光譜的差別以及對配基CO結(jié)合能力的變化。實驗結(jié)果表明，當(dāng)78位半胱氨酸被非極性氨基酸替代時，蛋白的還原態(tài)呈現(xiàn)五配位狀態(tài)，與野生型蛋白相似；當(dāng)其被極性氨基酸替代時，還原態(tài)呈現(xiàn)五，六配位混合態(tài)的狀態(tài)。同時，78位半胱氨酸被極性氨基酸替代時，，突變體對CO的結(jié)合能力都表現(xiàn)出不同程度的增強，而被非極性氨基酸替代的突變體則相對減弱。在課題組以往的工作中，曾利用其它同源蛋白對sGC卟啉結(jié)合結(jié)構(gòu)域進(jìn)行了同源模建，在同源模建的基礎(chǔ)上我們提出了78位氨基酸影響卟啉穩(wěn)定性的可能機制。78位極性氨基酸可能通過輔助小分子與卟啉鐵的作用影響卟啉的穩(wěn)定性。 另一方面，我們利用sGC β1(1-194)研究了半胱氨酸的亞硝基化。已有報道證明了C78的亞硝基化影響酶的活性。在本論文中我們利用傅里葉紅外光譜和定點突變清晰的檢測到了sGC β1(1-194)巰基信號并且為發(fā)生亞硝基化的位置提供了直接的光譜證據(jù)。紅外數(shù)據(jù)顯示，sGC β1(1-194)野生型和突變體(C78S和C122S)的巰基信號在2560cm-1左右。由于亞硝基化試劑的加入，巰基信號減弱，證明C78和C122發(fā)生了亞硝基化并且這種反應(yīng)是亞硝基化試劑GSNO濃度依賴的。

【關(guān)鍵詞】：
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：Q55
【目錄】：

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