本文選題：PARP1　切入點(diǎn)：PARylation　出處：《東北師范大學(xué)》2017年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：聚ADP核糖化,即PAR化修飾((PARylation),作為體內(nèi)重要的蛋白修飾過程主要由PARP家族中的PARP1介導(dǎo)發(fā)生。PARP1活化后通過對(duì)自身及其他蛋白的PAR化修飾參與到細(xì)胞的多種重要生物學(xué)事件中,如染色質(zhì)的改構(gòu),細(xì)胞的凋亡,DNA的損傷修復(fù)以及基因表達(dá)調(diào)控等。近年來,PARP1在靜息狀態(tài)或各種刺激下調(diào)節(jié)基因表達(dá)的作用越來越引發(fā)人們的關(guān)注。陸續(xù)有研究報(bào)道了PARP1在轉(zhuǎn)錄后水平對(duì)基因RNA代謝的影響,如,在小鼠胚胎成纖維細(xì)胞中PARP1能夠影響炎癥因子IP-10 mRNA的表達(dá),但具體機(jī)制沒有被闡明;PARP1還能通過對(duì)poly(A)聚合酶的PAR化修飾參與mRNA前體poly(A)尾巴的形成。這些研究都提示了PARP1能夠在轉(zhuǎn)錄后水平參與基因表達(dá)調(diào)控的可能性。轉(zhuǎn)錄后水平,尤其是mRNA穩(wěn)定性的調(diào)節(jié),主要由順式作用元件和反式作用因子共同調(diào)節(jié),順式作用元件是指mRNA自身上的結(jié)構(gòu),如3’UTR,5’UTR,編碼區(qū)等,反式作用因子是指那些與順式作用元件結(jié)合的蛋白。炎癥因子,細(xì)胞因子及一些原癌基因的mRNA皆為短命的mRNA,在其3’UTR含有一個(gè)AU富集的區(qū)域,被稱為ARE元件。ARE元件被認(rèn)為是mRNA上的不穩(wěn)定因素,能被眾多RNA結(jié)合蛋白結(jié)合,進(jìn)一步招募外切體,介導(dǎo)mRNA的降解。ARE元件及ARE結(jié)合蛋白共同影響這些mRNA的功能及命運(yùn)。其中ARE結(jié)合蛋白HuR,是為數(shù)不多已知的對(duì)mRNA起到穩(wěn)定性的一類蛋白。HuR蛋白不同形式的翻譯后修飾(如普遍關(guān)注的磷酸化修飾)被認(rèn)為是影響HuR功能的重要分子機(jī)制。我們實(shí)驗(yàn)室前期的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,PARP1能夠與RelA/p65相互作用并對(duì)p65進(jìn)行PAR化的修飾,進(jìn)而促進(jìn)NF-κB依賴的促炎相關(guān)炎癥因子的表達(dá)�；趍RNA穩(wěn)定性的調(diào)控能夠提供簡單,便捷又靈活的操控,炎癥因子的表達(dá)一般都受到嚴(yán)格的轉(zhuǎn)錄以及轉(zhuǎn)錄后的調(diào)控。這促使我們決定進(jìn)一步探究PARP1是否能夠影響炎癥因子及細(xì)胞因子mRNA的穩(wěn)定性。在我們的實(shí)驗(yàn)體系中,利用脂多糖LPS刺激小鼠巨噬細(xì)胞或給小鼠滴鼻給藥活化PARP1建立炎癥模型,在PARP1抑制劑PJ34或3-AB存在的情況下探究PARP1在轉(zhuǎn)錄后水平對(duì)基因的重要意義。1)通過細(xì)胞因子-炎癥因子矩陣實(shí)驗(yàn),我們發(fā)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)由LPS刺激引起的一系列促炎因子,包括Cxcl2 mRNA穩(wěn)定性的升高均能夠被PARP1抑制劑的加入顯著抑制,證明了PARP1對(duì)于炎癥因子mRNA穩(wěn)定性的調(diào)節(jié)作用;2)利用雙報(bào)告體系及干涉HuR并聯(lián)合共轉(zhuǎn)染PARP1的實(shí)驗(yàn),證明了PARP1是通過RNA結(jié)合蛋白HuR作用與ARE元件進(jìn)而影響mRNA的穩(wěn)定性;3)進(jìn)一步通過免疫共沉淀及體外激酶實(shí)驗(yàn)證明了PARP1與HuR的相互作用,以及對(duì)HuR的PAR化修飾,并且利用點(diǎn)突變證明了D226位點(diǎn)是HuR發(fā)生PAR化的主要位點(diǎn);4)接下來免疫熒光實(shí)驗(yàn)證明了PARP1對(duì)于HuR核質(zhì)穿梭的重要性;5)RNA凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)及RNA-IP實(shí)驗(yàn)則說明了HuR的PAR化修飾能夠促進(jìn)HuR與靶mRNA的結(jié)合;6)最后,通過對(duì)炎癥因子mRNA半衰期的檢測(cè),證實(shí)了HuR的D226位點(diǎn)對(duì)HuR的功能發(fā)揮起到重要的作用。這些結(jié)果都提示了一種新穎的機(jī)制,即PARP1能夠通過對(duì)RNA結(jié)合蛋白HuR的PAR化修飾作用,在轉(zhuǎn)錄后水平(通過對(duì)mRNA穩(wěn)定性的調(diào)節(jié))參與基因表達(dá)的調(diào)控。
[Abstract]:Poly ADP nuclear saccharification, that PAR modification ((PARylation), as an important protein modification process in vivo by PARP1 mediated PARP Family Guide.PARP1 activation by PAR modification to itself and other proteins involved in many important biological events in cells, such as chromatin remodeling, cell apoptosis, DNA damage repair and gene expression regulation. In recent years, and the role of PARP1 in the resting state or under the stimulation of regulation of gene expression more cause the attention of people. Many studies have reported the effects of PARP1 on the level of gene, RNA metabolism such as transcription, PARP1 in fibroblasts can affect the expression of inflammatory cytokines IP-10 mRNA in the mouse embryo, but the specific mechanism has not been elucidated; PARP1 is also based on the poly (A) polymerase PAR modification in pre mRNA poly (A) tail formation. These findings suggest that PARP1 can in turn The possibility of regulation of gene expression level of participation in the post transcriptional level. After the record, especially in the regulation of mRNA stability, mainly by the factor of cis acting elements and trans acting co regulation, cis acting element refers to the structure of mRNA itself, such as the 3 'UTR, 5' UTR, encoding region, trans acting factor are those with cis element protein. Inflammatory factors, cytokines and some oncogene mRNA are short-lived mRNA, in the 3 'UTR contains a AU enrichment area, known as the ARE component of.ARE components is considered unstable factors on the mRNA, can be many RNA combined with protein, further recruit the exosome mediated degradation of.ARE components, mRNA and ARE binding protein influence function and the fate of mRNA. The ARE binding protein HuR, is one of the few known mRNA of a kind of.HuR protein to the stability of different forms of translation Post-translational modification (such as attention phosphorylation) is considered to be an important molecular mechanism affecting the function of HuR. Our previous experimental results show that PARP1 can interact with RelA/p65 and modified PAR of p65, and promote NF- kappa B dependent proinflammatory related inflammatory cytokines expression and regulation of mRNA. The stability can provide a simple and convenient based on flexible manipulation, the general expression of inflammatory cytokines are strictly transcription and post transcription regulation. This led to our decision to further explore whether PARP1 can influence the inflammatory cytokines and cells due to the stability of sub mRNA. In our experiment, using LPS in macrophages or to LPS mice administered intranasally activated PARP1 an inflammation model of PARP1 gene at the post transcriptional level of significance of the.1 in the presence of the PARP1 inhibitor PJ34 or 3-AB). Cytokine - inflammatory factor matrix experiments, we found that cells stimulated by LPS caused a series of proinflammatory cytokines, including Cxcl2 increased the stability of mRNA can be added to inhibit PARP1 inhibitors, proved that PARP1 for inflammatory cytokines mRNA stability regulation; 2) using dual reporting system and HuR and co transfected with interference PARP1 experiments proved that PARP1 is affecting the stability of mRNA RNA binding protein HuR and ARE elements; 3) further by CO immunoprecipitation and in vitro kinase experiments proved that the interaction between PARP1 and HuR, and the HuR PAR modification, and the use of point mutations that D226 locus is the main site of HuR PAR; 4) following immunofluorescence experiments proved that PARP1 is important for HuR nucleocytoplasmic shuttling; 5) RNA gel retardation experiments and RNA-IP experiments indicate that the PAR modification of HuR can promote The combination of HuR and target mRNA 6); finally, through the detection of inflammatory factors of the half-life of mRNA, confirmed the function of D226 HuR on HuR sites play an important role. All of these results suggest a novel mechanism, namely PARP1 through RNA binding protein HuR PAR modification effect at the post transcriptional level (by regulating the stability of mRNA) is involved in regulation of gene expression.

【學(xué)位授予單位】：東北師范大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：Q75

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本文編號(hào)：1567377