本文選題：草食動物　切入點：產(chǎn)乙酸菌　出處：《浙江大學》2016年博士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：產(chǎn)乙酸菌利用氫氣和二氧化碳生成乙酸的代謝特征使其在化學物質(zhì)和生物燃料的生產(chǎn)上得到了廣泛關(guān)注；由于其與產(chǎn)甲烷菌擁有共同的代謝底物,因此通過強化反芻動物瘤胃內(nèi)乙酸生成途徑,既有能為宿主提供能量又有可能減少因甲烷產(chǎn)生造成的飼料能損失。而草食動物消化道中產(chǎn)乙酸菌的組成及其在甲烷控制中的作用機制鮮有報道。本研究的目的在于通過研究奶牛、肉牛、湖羊的瘤胃、袋鼠的前胃、兔子盲腸和馬的糞便中產(chǎn)乙酸菌的群落組成,探討宿主種類、發(fā)酵模式、消化道部位等因素對產(chǎn)乙酸菌分布的影響；通過研究相同飼養(yǎng)環(huán)境和飼糧水平下不同日齡兔子盲腸內(nèi)容物中產(chǎn)乙酸菌的群落組成,探討宿主發(fā)育對產(chǎn)乙酸菌分布的影響；通過對牛、羊的瘤胃內(nèi)容物,兔子盲腸內(nèi)容物和馬糞便中的產(chǎn)乙酸菌進行富集培養(yǎng),探討不同種類草食動物消化道內(nèi)產(chǎn)乙酸菌氫利用能力的差異性；通過單獨或聯(lián)合添加外源產(chǎn)乙酸菌與酵母培養(yǎng)物,以及在抑制產(chǎn)甲烷菌活動的基礎(chǔ)上添加產(chǎn)乙酸菌或間苯三酚,探討通過強化瘤胃乙酸生成途徑實現(xiàn)瘤胃發(fā)酵調(diào)控和甲烷減排的可行性。1.不同種類宿主和消化道部位內(nèi)產(chǎn)乙酸菌的群落組成特征：通過瘤胃瘺管技術(shù)采集6頭泌乳后期奶牛、4只四月齡湖羊瘤胃內(nèi)容物,通過屠宰技術(shù)采集6只六月齡日本大耳白兔盲腸內(nèi)容物,通過蹲點取樣的辦法采集4匹四歲澳洲馬的糞便,利用構(gòu)建克隆文庫的方法,并結(jié)合Genbank中澳大利亞袋鼠前胃和肉牛瘤胃中產(chǎn)乙酸菌ACS (acetyl-CoA synthase)基因的序列信息,分析奶牛、肉牛、湖羊、袋鼠、兔子、馬消化道內(nèi)產(chǎn)乙酸菌群落組成的差異性。研究發(fā)現(xiàn),奶牛、湖羊、肉牛瘤胃,袋鼠前胃,兔子盲腸,馬的糞便內(nèi)產(chǎn)乙酸菌的群落組成因物種、消化道部位的不同呈現(xiàn)出明顯的個體差異。奶牛、湖羊、肉牛瘤胃,袋鼠前胃,兔子盲腸和馬的糞便內(nèi)ACS OTU數(shù)目分別為18,14,23,12,31和65,后腸發(fā)酵的馬和兔子產(chǎn)乙酸菌菌群的均一性更好。同為前胃發(fā)酵的奶牛、肉牛、湖羊和袋鼠,產(chǎn)乙酸菌的群落組成有很大差異,反芻動物奶牛、肉牛和湖羊有4個共有的OTU,而袋鼠與它們均沒有共同的OTU；同為反芻動物的奶牛和湖羊共有的OTU最多,為9個,并且優(yōu)勢菌種均為OTU 3。同為后腸發(fā)酵的兔子和馬雖然共有3個OTU,但馬的優(yōu)勢菌種是OTU 14,兔子是OTU 74。馬、兔子和袋鼠均為單胃草食動物,袋鼠和馬共有2個OTU,和兔子沒有共有的OTU,并且其優(yōu)勢菌種是OTU 46,與兔子和馬均不相同。物種分類的結(jié)果進一步證實了不同種類宿主和消化道部位內(nèi)產(chǎn)乙酸菌組成的差異性,奶牛和湖羊瘤胃內(nèi)產(chǎn)乙酸菌的優(yōu)勢菌種與Acetitomaculum ruminis相似度最高(相似度為87%),肉牛瘤胃、袋鼠前胃、兔子盲腸和馬的糞便中產(chǎn)乙酸菌的優(yōu)勢菌種分別與Blautia hydrogenotrophica、Blautia hydrogenotrophica、 Blautia hydrogenotrophica、Blautia producta具有最高的相似度,相似度分別為80%、77%、90%和76%。從系統(tǒng)進化發(fā)育上來看,產(chǎn)乙酸菌在單胃草食動物(袋鼠、兔子和馬)消化道內(nèi)的物種分類更加豐富,隸屬于Ruminococcaceae, Lachnospiraceae, Eubacteriaceae和Clostridiaceae科,而在反芻動物瘤胃內(nèi)主要集中在Lachnospiraceae和Clostridiaceae科。利用熒光定量PCR的方法對奶牛、湖羊、兔子和馬消化道內(nèi)產(chǎn)乙酸菌的功能基因FTHFS (formylterahydrofolate synthetase)和產(chǎn)甲烷菌的功能基因mcrA (methyl coenzyme-M reductase)進行定量,研究發(fā)現(xiàn),奶牛和湖羊瘤胃內(nèi)容物、馬的糞便以及兔子盲腸內(nèi)容物中均有大量的產(chǎn)乙酸菌存在,并且其相對于總菌的數(shù)量在奶牛和湖羊瘤胃內(nèi)容物、馬的糞便以及兔子盲腸內(nèi)容物中差異不顯著。產(chǎn)甲烷菌作為一種重要的氫利用菌,在奶牛瘤胃內(nèi)容物中的相對數(shù)量顯著高于馬的糞便和兔盲腸內(nèi)容物(P0.05)。2.發(fā)育階段對草食動物消化道產(chǎn)乙酸菌群落的影響：通過屠宰技術(shù),采集相同飼養(yǎng)環(huán)境下飼喂相同飼糧的1、2、4、6月齡新西蘭大耳白兔的盲腸內(nèi)容物,各6只,利用高通量測序和熒光定量PCR的方法分析不同日齡兔子盲腸內(nèi)容物中產(chǎn)乙酸菌的組成情況。研究發(fā)現(xiàn),兔子盲腸內(nèi)有大量未知的產(chǎn)乙酸菌存在,4個月齡的兔子盲腸內(nèi)容物中共檢測到了6101個ACS OTU,4個月齡兔子盲腸內(nèi)容物中產(chǎn)乙酸菌的數(shù)量無顯著性差異。但產(chǎn)乙酸菌的群落組成會因日齡的增長發(fā)生改變,并且越來越趨向穩(wěn)定。1和6月齡的兔子盲腸內(nèi)容物中產(chǎn)乙酸菌的群落組成差異最大,有131個OTU豐度差異顯著(P0.05),而4和6月齡的兔盲腸內(nèi)容物中產(chǎn)乙酸菌的豐度無顯著差異,隨著日齡增長,產(chǎn)乙酸菌群落組成的組間差異越來越小,預示著腸道產(chǎn)乙酸菌會在發(fā)育中趨于穩(wěn)定和同質(zhì)化。1和6月齡間差異顯著的OTU分布在系統(tǒng)發(fā)生樹上的不同位置,產(chǎn)乙酸菌種類的差異性可能與不同日齡兔子盲腸中乙酸生成途徑不同有關(guān)。3.草食動物消化道產(chǎn)乙酸菌富集培養(yǎng)物氫利用能力的研究：通過對奶牛、湖羊、兔子、馬消化道內(nèi)的產(chǎn)乙酸菌進行富集培養(yǎng),研究了草食動物消化道產(chǎn)乙酸菌富集培養(yǎng)物利用合成氣(氫氣和二氧化碳)生成能量物質(zhì)(乙酸、丙酸、丁酸)的能力。研究發(fā)現(xiàn),馬的糞便、兔盲腸內(nèi)容物、奶牛和湖羊瘤胃內(nèi)容物中的產(chǎn)乙酸菌經(jīng)過富集培養(yǎng)后,在厭氧培養(yǎng)條件下菌體表現(xiàn)出相似的生長和氫利用特征,富集培養(yǎng)物均在培養(yǎng)48 h時達到最大菌體濃度,最主要的代謝產(chǎn)物為乙酸,同時也生成微量的丙酸、丁酸、異戊酸等副產(chǎn)物,但均不生成甲烷。培養(yǎng)48 h內(nèi),馬的糞便、兔盲腸內(nèi)容物、奶牛和湖羊瘤胃內(nèi)容物富集的產(chǎn)乙酸菌分別可以利用4.75、5.17、5.53和5.23 moles的氫氣生成1 mole的乙酸,馬糞便內(nèi)富集的產(chǎn)乙酸菌氫利用效率顯著高于其他樣品(P0.05)。同為反芻動物的奶牛和湖羊,瘤胃內(nèi)容物中富集的產(chǎn)乙酸菌在48 h的培養(yǎng)過程中,氫氣消耗量無顯著差異,但是乙酸生成的量湖羊顯著高于奶牛(P0.05)；同為單胃草食動物的馬和兔子,富集的產(chǎn)乙酸菌在48 h的培養(yǎng)過程中,氫氣消耗量無顯著差異,但是乙酸生成的量馬顯著高于兔子(P0.05)。所有樣品的產(chǎn)乙酸菌富集培養(yǎng)物均可生成丁酸,并且馬糞便樣品顯著高于其他樣品(P0.05)。4.單獨或聯(lián)合添加外源產(chǎn)乙酸菌TWA4和酵母培養(yǎng)物對瘤胃發(fā)酵和產(chǎn)乙酸菌群落的影響：試驗采用2×2雙因素試驗設(shè)計,產(chǎn)乙酸菌TWA4的添加量為0和2×107 cells/ml,釀酒酵母發(fā)酵物XP的添加量為0和2g/L。研究發(fā)現(xiàn),單獨添加XP以及TWA4和XP聯(lián)合添加可增加揮發(fā)性脂肪酸產(chǎn)量(P0.05),TWA4和XP聯(lián)合添加顯著增加了甲烷生成量(P0.05)�；趯Ξa(chǎn)乙酸菌功能基因FTHFS的定量,發(fā)現(xiàn)單獨添加TWA4、XP以及兩者聯(lián)合添加均增加了產(chǎn)乙酸菌的數(shù)量,且其增長幅度高于產(chǎn)甲烷菌。各處理組的產(chǎn)乙酸菌均以Lachnospiraceae為主,但與已培養(yǎng)的微生物相似性較低。與A cetitomaculum ruminis具有低相似性(相似度86%)的一類未知的產(chǎn)乙酸菌在各處理中均占優(yōu)勢,但XP的添加增加了與Eubacterium limosum具有低相似性(相似度70%)的未知產(chǎn)乙酸菌的數(shù)量。與XP不同,TWA4及其與XP的聯(lián)合添加使與A.ruminis具有低相似性的一類未知的產(chǎn)乙酸菌的數(shù)量增加,與E. limosum具有低相似性的未知產(chǎn)乙酸菌的數(shù)量降低。因此,外源添加產(chǎn)乙酸菌和(或)酵母可能通過調(diào)控瘤胃產(chǎn)乙酸菌群落組成對瘤胃發(fā)酵和甲烷生成產(chǎn)生影響。5.產(chǎn)甲烷菌抑制劑-氯仿對瘤胃發(fā)酵、甲烷生成和微生物群落的影響：飼喂精粗比為40：60的混合日糧和僅飼喂粗飼料兩種飼養(yǎng)模式下,選取體重相似的八頭健康肉牛(每種飼喂方式各四頭)進行為期78天的動物試驗。根據(jù)氯仿添加量分為4個處理：基礎(chǔ)飼糧(精粗比為40：60的混合日糧或干草)加環(huán)糊精為對照組；在對照組基礎(chǔ)上添加1.0 g/100 kg LW (Live weight)的環(huán)糊精氯仿為低劑量組；在對照組基礎(chǔ)上添加1.6g/100 kg LW的環(huán)糊精氯仿為中劑量組；在對照組基礎(chǔ)上添加2.0g/100kgLW的環(huán)糊精氯仿(粗飼料飼養(yǎng)模式)或添加2.6 g/100 kg LW的環(huán)糊精氯仿(精粗比為40：60的混合日糧飼養(yǎng)模式)為高劑量組。研究發(fā)現(xiàn),氯仿的添加均對肉牛的采食量無顯著性影響。僅飼喂粗飼料時,氯仿的添加會使動物采食3h后瘤胃液氨態(tài)氮濃度顯著升高(P0.05),高劑量的添加會使揮發(fā)性脂肪酸產(chǎn)量顯著下降；而飼喂混合日糧時,三種劑量氯仿的添加未對瘤胃液氨態(tài)氮濃度和揮發(fā)性脂肪酸濃度造成顯著性影響。兩種飼喂模式下,中、高劑量氯仿的添加均使動物的甲烷排放量顯著降低(P0.01),氫氣的排放量顯著增多(P0.05),并且采食前后瘤胃液的乙酸濃度顯著降低(P0.01),丙酸濃度顯著升高(P0.05),乙丙比顯著下降(P0.01)。飼喂混合日糧時,低、中劑量氯仿的添加均使產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌(Fibrobacter succinogenes)和原蟲的數(shù)量顯著增加(P0.05),高劑量氯仿使Methanobrevibacter ruminantium和功能基因mcrA的基因拷貝數(shù)顯著降低(P0.05),但是Rumen cluster C的數(shù)量顯著升高(P0.05)；僅飼喂粗飼料時,中、高劑量氯仿的添加顯著增加了白色瘤胃球菌(Ruminococcus albus)的數(shù)量(P0.05),對其他菌群的數(shù)量無顯著性影響。兩種飼喂模式下,三種劑量氯仿的添加均使瘤胃微生物菌群的組成發(fā)生了改變,并且顯著地改變了瘤胃內(nèi)某些與纖維分解和甲烷生成有關(guān)的菌屬(Fibrobacter、Ruminococcus、 Methanobrevibacter)的豐富度(P0.05),與丙酸和丁酸生成相關(guān)的菌屬Succiniclasticum和Butyrivibrio的豐富度也發(fā)生了顯著性改變(P0.05),與非甲烷生成的氫代謝通路密切相關(guān)的菌屬如Desulfovibrio的豐富度也發(fā)生了顯著性變化(P0.05)。氯仿對瘤胃微生物菌群的影響具有一定的持續(xù)性,停止使用15天后,瘤胃微生物菌群組成與添加氯仿前明顯不同,并且Ruminococcus、 Methanobrevibacter等菌屬的豐度度也發(fā)生了顯著性變化(P0.05)。6.抑制瘤胃甲烷生成的基礎(chǔ)上外源添加產(chǎn)乙酸菌TWA4和間苯三酚對瘤胃發(fā)酵和甲烷生成的影響：選取八頭體重相似的健康肉牛進行為期79天的動物試驗,試驗分兩階段進行。第一階段根據(jù)是否添加間苯三酚分為兩個處理：基礎(chǔ)日糧(精粗比為40：60的混合日糧)加1.6g/100kgLW的環(huán)糊精氯仿為對照組；對照組基礎(chǔ)上添加75g/100kgLW的間苯三酚為處理組。第二階段根據(jù)是否添加產(chǎn)乙酸菌TWA4分為兩個處理：基礎(chǔ)日糧(精粗比為40：60的混合日糧)加1.6g/100kgLW的環(huán)糊精氯仿,并添加700 ml/d未接種TWA4的培養(yǎng)基為對照組；基礎(chǔ)日糧(精粗比為40：60的混合日糧)加1.6g/100kgLW的環(huán)糊精氯仿,并添加700 ml/d的TWA4培養(yǎng)液為處理組。研究發(fā)現(xiàn),與僅添加產(chǎn)甲烷菌抑制劑-氯仿的對照組相比,乙酸生成誘導劑間苯三酚的添加雖然沒有進一步對甲烷生成造成顯著性影響,但是肉牛的氫氣排放量顯著降低(P0.05),并且肉牛采食3h后瘤胃液揮發(fā)性脂肪酸中乙酸含量顯著升高(P0.05),說明間苯三酚可以使甲烷生成過程受到抑制后多余的氫向乙酸合成方向進行�；趯Ξa(chǎn)乙酸菌功能基因FTHFS的定量,發(fā)現(xiàn)間苯三酚的添加并沒有對瘤胃液中產(chǎn)乙酸菌的數(shù)量產(chǎn)生顯著性影響。與僅添加產(chǎn)甲烷菌抑制劑-氯仿的對照組相比,產(chǎn)乙酸菌TWA4的添加并沒有進一步對肉牛的甲烷和氫氣排放量產(chǎn)生顯著性影響,瘤胃液氨態(tài)氮、揮發(fā)性脂肪酸以及乙酸濃度也未發(fā)生顯著性變化,基于對產(chǎn)乙酸菌功能基因FTHFS的定量,發(fā)現(xiàn)TWA4的添加并沒有對瘤胃液中產(chǎn)乙酸菌的數(shù)量產(chǎn)生顯著性影響。綜上所述,草食動物消化道內(nèi)有大量且豐富的產(chǎn)乙酸菌存在,并且由于宿主種類、消化道部位和宿主發(fā)育階段的不同呈現(xiàn)出不同的群落組成特征。草食動物消化道內(nèi)的產(chǎn)乙酸菌富集培養(yǎng)物可以將合成氣(H2和C02)轉(zhuǎn)化為乙酸、丙酸、丁酸等能量物質(zhì),并且不同種類草食動物消化道內(nèi)產(chǎn)乙酸菌的氫利用能力存在差異性。通過外源添加產(chǎn)乙酸菌來實現(xiàn)瘤胃甲烷減排效果不理想,配合使用酵母培培養(yǎng)物可以增加瘤胃內(nèi)某些產(chǎn)乙酸菌的豐富度從而影響瘤胃發(fā)酵,在瘤胃產(chǎn)甲烷菌活動受到抑制時,間苯三酚可以促進瘤胃內(nèi)乙酸生成途徑的發(fā)生。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：浙江大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：S852.6
，

本文編號：1561035