發(fā)布時(shí)間：2018-02-26 18:37

  本文關(guān)鍵詞： Lkb1 葡萄糖代謝 糖酵解 丙酮酸脫氫酶激酶pdk2 斑馬魚早期發(fā)育　出處：《中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)》2016年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：絲氨酸／蘇氨酸蛋白激酶LKB1的編碼基因是Peutz-Jeghers綜合癥的致病基因。LKB1不僅是一個(gè)重要的腫瘤抑制因子,而且在細(xì)胞生長(zhǎng)、極性和細(xì)胞能量代謝等過程中具有重要的調(diào)節(jié)功能。但在生理?xiàng)l件下,LKB1如何在整體水平上調(diào)控代謝平衡以及相關(guān)的生化機(jī)制尚待闡明。本研究通過利用Tol2轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)的斑馬魚基因捕獲突變體篩選,獲得了斑馬魚lkbl突變體。由To12轉(zhuǎn)座子酶介導(dǎo)含有EGFP編碼序列的轉(zhuǎn)座子元件插入到lkbl基因的第一個(gè)內(nèi)含子中。該突變體因剪接獲得新的融合轉(zhuǎn)錄本,該融合轉(zhuǎn)錄本僅包含lkbl的第一個(gè)外顯子和EGFP的編碼序列。同時(shí),由于斑馬魚lkbl基因的翻譯起始密碼子位于其第二個(gè)外顯子中,因而由這個(gè)融合轉(zhuǎn)錄本翻譯獲得的融合蛋白僅包含EGFP自身,導(dǎo)致突變體中內(nèi)源lkbl的表達(dá)在轉(zhuǎn)錄水平和蛋白水平被顯著阻斷。我們發(fā)現(xiàn),在正常喂養(yǎng)條件下,lkbl突變體幼魚在受精后第7天開始出現(xiàn)死亡,在受精后第25天內(nèi)全部死亡；但在不飼喂條件下,lkbl突變體幼魚在受精后第7天開始死亡,并且死亡速率顯著增加,在受精后第12天前全部死亡。受精后第7天的1kbl突變體幼魚的肝臟顏色明顯變深,而且腸道壁的褶皺明顯減少,能量存儲(chǔ)異常快速地消耗衰竭,表現(xiàn)出饑餓應(yīng)激的表型。Lkbl缺失導(dǎo)致幼魚早期死亡,表明斑馬魚lkbl對(duì)維持生存是必需的。我們將研究關(guān)注在受精后第5天之前的發(fā)育時(shí)期,在此階段,斑馬魚胚胎發(fā)育依賴于卵黃為其提供能量和物質(zhì)供給,沒有饑餓應(yīng)激刺激,因此可以保證在正常生理?xiàng)l件下研究Lkbl在維持整體能量代謝平衡中的功能。我們的實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證明,Lkbl缺失會(huì)破壞突變體體內(nèi)葡萄糖水平的動(dòng)態(tài)平衡。與野生型對(duì)照相比,lkbl突變體在受精后36小時(shí)和第2天分別表現(xiàn)出較高的葡萄糖水平,而在受精后第4天和第5天突變體體內(nèi)的葡萄糖水平卻顯著低于野生型。這些結(jié)果首次證明,先于卵黃未消耗完之前,Lkbl缺失已導(dǎo)致斑馬魚胚胎整體葡萄糖水平異常,提示在斑馬魚早期發(fā)育過程中,Lkbl對(duì)維持葡萄糖代謝平衡是至關(guān)重要的。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),Lkbl缺失導(dǎo)致糖異生過程中關(guān)鍵的限速酶磷酸烯醇丙酮酸羧激酶1(pepck1)和葡萄糖-6-磷酸酶(g6pase)的轉(zhuǎn)錄水平顯著上調(diào)。為了探究Lkbl缺失造成斑馬魚體內(nèi)葡萄糖代謝異常的內(nèi)在機(jī)制,我們首先檢測(cè)了葡萄糖代謝的下游產(chǎn)物,發(fā)現(xiàn)lkbl突變體中乳酸水平異常升高。進(jìn)一步研究表明,Lkbl缺失導(dǎo)致丙酮酸脫氫酶激酶2(pdk2)的表達(dá)水平上調(diào),進(jìn)而造成丙酮酸脫氫酶(Pdh)磷酸化水平升高,并由此導(dǎo)致丙酮酸脫氫酶復(fù)合體(Pdc)活性下降,使得葡萄糖代謝向乳酸生成增多的糖酵解方向進(jìn)行,造成lkbl突變體中乳酸水平異常升高。這可能是Lkbl缺失導(dǎo)致斑馬魚體內(nèi)葡萄糖代謝平衡異常的內(nèi)在的生化機(jī)制。由Lkbl缺失造成的葡萄糖代謝異常與腫瘤細(xì)胞所特有的有氧糖酵解增強(qiáng),即Warburg效應(yīng)高度相似。利用癌癥治療的候選藥物二氯乙酸鹽DCA (Dichloroacetate)抑制Pdk2活性,可以增強(qiáng)Pdc活性,有效地挽救由Lkbl缺失造成的乳酸積累異常的表型。提示我們的lkbl突變體或許可以為癌癥治療中以有氧糖酵解為靶點(diǎn)的藥物篩選提供一個(gè)可能的平臺(tái)。
[Abstract]:The gene encoding serine / threonine protein kinase LKB1 is a causative gene of.LKB1 Peutz-Jeghers syndrome is not only an important tumor suppressor, and in cell growth, has an important regulatory function of polarity and cell energy metabolism. But under physiological conditions, LKB1 in the overall level of metabolic balance and related regulation the biochemical mechanism remains to be elucidated. In this study, the zebrafish genes transposon mediated by Tol2 capture mutant selection, the zebrafish lkbl mutant. By To12 transposon mediated enzyme containing inserted into the first intron of the lkbl gene in transposable element EGFP encoding sequences. The mutant was obtained new fusion transcript splicing and the first exon and EGFP sequence encoding the fusion transcript contains only lkbl. At the same time, because of the translation initiation codon of lkbl gene in the zebrafish The second exons, and the fusion transcript translation fusion protein contains only the EGFP itself, leading to the endogenous expression of lkbl mutants was significantly inhibited at the transcriptional level and protein level. We found that in normal feeding conditions, the lkbl mutant in juvenile sperm appeared seventh days after the death, the death of all in twenty-fifth days after fertilization; but in feeding conditions, lkbl mutant juvenile began to die in seventh days after fertilization, and the death rate increased significantly in twelfth days after fertilization. After fertilization 1kbl mutant died seventh days juvenile liver color was darker, and the intestinal wall fold significantly reduced, energy storage abnormal fast consumption failure, showed the phenotype of.Lkbl deletion of hunger stress leads to early death of juvenile zebrafish lkbl, that is necessary for survival. We will focus on research after fertilization Fifth days before the period of development, at this stage, zebrafish embryo development depends on the yolk to provide energy and material supplies for its hunger, stress, so we can study Lkbl while maintaining the overall balance of energy metabolism in function in normal physiological conditions. We guarantee the experiment further proved that the dynamic balance of Lkbl deletion disrupts the glucose level the body of the mutant. Compared with wild-type controls, lkbl mutants in 36 hours after fertilization and second days respectively showed higher levels of glucose, and in fourth days and fifth days after fertilization in grape sugar levels but mutants were significantly lower than the wild type. These results demonstrate for the first time, before the yolk did not consume, Lkbl has been missing in zebrafish embryos whole abnormal glucose levels, suggesting that in the early development of zebrafish, Lkbl is vital to maintain glucose homeostasis further. The study found that Lkbl deletion resulted in gluconeogenesis in enzyme phosphoenolpyruvate carboxykinase 1 key (pepck1) and glucose -6- phosphatase (G6Pase) transcription level was significantly increased. In order to explore the internal mechanism of Lkbl caused by the lack of abnormal glucose metabolism in zebrafish, we first examined the downstream products of glucose metabolism and lactate level the lkbl mutant abnormalincreased. Further study showed that Lkbl deletion resulted in pyruvate dehydrogenase kinase 2 (PDK2) expression level increased, resulting in pyruvate dehydrogenase (Pdh) phosphorylation level increases, which leads to the pyruvate dehydrogenase complex (Pdc) activity decreased the glucose metabolism to lactate production increased glycolysis direction. The levels of lactic acid in the lkbl mutant caused by abnormal. This may be caused by Lkbl deletion in zebrafish glucose generation Xie Ping scale abnormal inner The biochemical mechanism of glucose metabolism caused by Lkbl deficiency. The abnormal and specific tumor cells of aerobic glycolysis is enhanced and that the Warburg effect is highly similar. Using the two drug candidate chloracetate DCA cancer treatment (Dichloroacetate) inhibit the activity of Pdk2, can enhance the activity of Pdc, effectively save the Lkbl caused by the lack of accumulation of lactic acid the abnormal phenotype. We suggest that lkbl mutants may be for cancer treatment by aerobic glycolysis for drug target screening may provide a platform.

【學(xué)位授予單位】：中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：Q78;Q591.4

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本文編號(hào)：1539197