本文關(guān)鍵詞： 蛋白質(zhì)折疊性質(zhì) 蛋白質(zhì)設(shè)計 定向進化 核磁結(jié)構(gòu)解析　出處：《中國科學技術(shù)大學》2016年博士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：蛋白質(zhì)設(shè)計目前面臨的最為棘手的一個問題就是怎樣高效地挑選出折疊性質(zhì)好的蛋白序列。對大量的設(shè)計蛋白序列都進行徹底的結(jié)構(gòu)研究,既不現(xiàn)實也不值得。在這里,我們建立了一個可以有效地評估并且改進設(shè)計蛋白折疊性質(zhì)的實驗方法。該方法中,目的蛋白的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性與細菌的抗生素抗性呈正相關(guān),在目的蛋白兩端連上連接序列后,插入到TEM1-β-內(nèi)酰胺酶中間,形成一個三明治樣結(jié)構(gòu)。折疊性質(zhì)差的目的蛋白在周質(zhì)腔中會被蛋白酶特異性地識別為非折疊蛋白進而被水解,表現(xiàn)為宿主細胞的低抗生素抗性。利用該系統(tǒng)不僅可以幫助我們評估設(shè)計蛋白的折疊性質(zhì),還可以在定向進化后篩選出能夠彌補設(shè)計缺陷的突變體。我們以硫氧還蛋白的主鏈結(jié)構(gòu)(PDB ID為1r26)作為設(shè)計模板,該蛋白具有113個氨基酸,形成了四個α-螺旋圍繞著五個p-折疊的三維結(jié)構(gòu)。在初次設(shè)計時,設(shè)計蛋白Dv_1r26在T EM1-β-內(nèi)酰胺酶胞內(nèi)系統(tǒng)顯示出了很低的抗生素抗性,暗示著該設(shè)計蛋白的折疊性質(zhì)差,與核磁一維氫譜實驗結(jié)果一致。基于TEM1-β-內(nèi)酰胺酶胞內(nèi)系統(tǒng)對Dv 1r26進行了三輪定向進化,我們獲得了一系列表現(xiàn)為高抗性的突變體,其中V31D,V61D和W105R這三個點突變在這些突變體中被頻繁地觀測到,我們選擇突變體Dv_1r26_M1做為進一步的實驗對象,該突變體僅含有四個點突變,包含被頻繁觀測到的三個位點突變和L23P。Dv_1r26_M1的一維氫譜和HSQC譜都具有很好的分散度,暗示著它的折疊性質(zhì)良好。對Dv_1r26_M1進一步進行徹底的核磁結(jié)構(gòu)實驗分析可以看到：該蛋白的p-折疊片折疊性質(zhì)良好,而且折疊片間的走向與設(shè)計結(jié)構(gòu)一致,但是N端的α螺旋沒有形成,C端的螺旋部分部分折疊�；趯Τ跏荚O(shè)計序列可能存在的問題的分析,我們對設(shè)計方法進行了一些微小但十分重要的調(diào)整,使用修正后的設(shè)計模型設(shè)計出了新的蛋白序列,命名為E_1r26,它無需經(jīng)過定向進化就在TEM1-β-內(nèi)酰胺酶胞內(nèi)系統(tǒng)中顯示出了很高的抗生素抗性,隨即對其進行了核磁結(jié)構(gòu)解析。結(jié)果顯示：計算出的E_1r26NMR模型與設(shè)計模板1r26高度一致,其中能量最低的模型與設(shè)計模板的主鏈重原子RMSD僅為1.7埃。此外,我們還測試了熒光蛋白Insertion Reporter系統(tǒng)對于蛋白質(zhì)折疊性質(zhì)的靈敏性。在對三個不同折疊性質(zhì)的蛋白進行評估時,并沒有看到明顯的區(qū)別,無法做到對蛋白折疊性的有效評估。
[Abstract]:One of the most difficult problems in protein design is how to efficiently select protein sequences with good folding properties. It is neither realistic nor worthwhile to study thoroughly the structure of a large number of design protein sequences. We have established an experimental method that can effectively evaluate and improve the folding properties of the protein. In this method, the structural stability of the target protein is positively correlated with the antibiotic resistance of the bacteria. Inserted into the middle of TEM1- 尾 -lactamases to form a sandwich like structure. Proteins with poor folding properties are specifically recognized by protease as non-folded proteins in the periplasmic cavity and then hydrolyzed. Low antibiotic resistance in host cells. Using this system can not only help us assess the folding properties of design proteins, We used thioredoxin's main chain structure (PDB ID = 1r26) as the design template, and the protein had 113 amino acids. In the initial design, the design protein Dv_1r26 showed low antibiotic resistance in the intracellular system of T EM1- 尾 -lactamases, suggesting that the design protein had poor folding properties. In accordance with the results of nuclear magnetic one-dimensional hydrogen spectroscopy, we obtained a series of highly resistant mutants based on TEM1- 尾 -lactamase intracellular system for three rounds of directed evolution of Dv1r26. The three point mutations of V31D V61D and W105R were observed frequently in these mutants. We chose the mutant Dv_1r26_M1 as the further experiment object, the mutant contains only four point mutations. The one-dimensional hydrogen spectrum and HSQC spectrum of L23P.Dv26M1 and L23P.Dv26M1 have good dispersion. A further thorough analysis of the nuclear magnetic field (NMR) structure of Dv_1r26_M1 shows that the pfolding-sheet of the protein has good folding properties, and the orientation of the folding sheet is consistent with the design structure. But the a-helix of the N-terminal does not form the spiral part of the C-terminal. Based on the analysis of the possible problems in the initial design sequence, we have made some minor but very important adjustments to the design method. Using the modified design model, a new protein sequence was designed, named E _ S _ 1r _ (26), which showed high antibiotic resistance in the intracellular system of TEM1- 尾 -lactamases without directional evolution. The results show that the calculated 1r26 NMR model is highly consistent with the design template 1r26, and the RMSD of the main chain weight atom of the lowest energy model and the design template is only 1. 7 A. We also tested the sensitivity of the fluorescent protein Insertion Reporter system to the folding properties of proteins. When we evaluated the three proteins with different folding properties, we did not see obvious differences and could not effectively evaluate the folding properties of proteins.
【學位授予單位】：中國科學技術(shù)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：Q51

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8 沈，

本文編號：1509639