本文關(guān)鍵詞： Pif1解旋酶 G4 DNA 快速停留熒光檢測技術(shù) 單分子熒光能量共振轉(zhuǎn)移技術(shù) 熒光偏振檢測技術(shù)　出處：《西北農(nóng)林科技大學(xué)》2015年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：鳥苷酸-四聯(lián)體結(jié)構(gòu)(G-quadruplex DNA,簡稱G4 DNA)是一種富含鳥苷酸(G)序列的四鏈形態(tài)的DNA二級結(jié)構(gòu),它在胞體內(nèi)可以發(fā)揮各種各樣的功能,如維持端粒穩(wěn)定,參與DNA復(fù)制起始調(diào)控等。如果解旋G4結(jié)構(gòu)失敗,則會影響細(xì)胞內(nèi)DNA的正常代謝,導(dǎo)致基因組的不穩(wěn)定。生物體內(nèi)同時進(jìn)化出解鏈G4結(jié)構(gòu)的解旋酶;其中Pif1解旋酶被證實在體內(nèi)與體外實驗中都具有很強的解旋G4 DNA的活性。近年來,越來越多的研究主要在酵母的Sc Pif1與人類的hPif1解旋酶的生理生化特征與遺傳學(xué)方面展開。但是原核生物Pif1解旋酶的潛在功能和生化特性到目前為止仍然不清楚;ScPif1解旋酶與G4 DNA反應(yīng)的動力學(xué)機理也尚不明確;而且Pif1蛋白在單分子水平上如何解旋G4結(jié)構(gòu)也是一項亟待解旋的重要課題。本文針對以上問題,分別從以下三個方面展開相關(guān)研究:利用擬桿菌Pif1解旋酶(BsPif1)進(jìn)行原核生物Pif1蛋白的生化特征與動力學(xué)機理的研究;同時,采用快速停留熒光技術(shù)監(jiān)測重組ScPif1解旋酶解旋含G4結(jié)構(gòu)DNA底物的反應(yīng)動力學(xué)過程。此外,使用單分子能量共振轉(zhuǎn)移檢測技術(shù)研究Pif1解旋酶催化G4結(jié)構(gòu)解旋反應(yīng)的分子機制。這些研究旨在闡明Pif1解旋酶解旋G4 DNA的動力學(xué)特征與分子機制,為深入解析Pif1解旋酶的生理功能提供理論依據(jù)。主要研究成果如下:1,首次系統(tǒng)研究原核生物Pif1解旋酶——BsPif1的生化特征與解旋動力學(xué)機理。研究結(jié)果顯示:1)BsPif1解旋酶以單體形式存在并發(fā)揮功能。2)BsPif1也具有Pif1家族解旋酶的許多共性。3)作為原核生物Pif1解旋酶的代表,BsPif1在解旋底物特異性等多方面與真核生物ScPif1解旋酶之間存在較大差異。4)BsPif1蛋白可以順利解旋G4DNA底物,并具有獨特的動力學(xué)機理。這些結(jié)果說明,Bs Pif1蛋白可以有效的解決在DNA代謝過程中出現(xiàn)的各類問題,暗示出該解旋酶可能參與許多重要生理功能。此外,BsPif1在底物特異性與解旋行為模式等方面,都不同于酵母Pif1,而是更類似于人類Pif1解旋酶。2,在研究ScPif1解旋酶解旋G4 DNA底物的動力學(xué)過程中首次發(fā)現(xiàn)G4 DNA可以極大的增強Pif1蛋白解旋G4結(jié)構(gòu)后雙鏈DNA活性的現(xiàn)象。研究結(jié)果顯示:1)ScPif1蛋白可以高效地解旋含G4結(jié)構(gòu)的雙鏈DNA,并證實該反應(yīng)依賴ATP供能。2)G4結(jié)構(gòu)極大地激活Pif1蛋白解旋雙鏈DNA的活性,并且該現(xiàn)象具有其自身結(jié)構(gòu)特點;而G3結(jié)構(gòu)卻不能激活Pif1蛋白。3)這種激活效應(yīng)通過增強解旋速率,解旋步長及解旋持續(xù)性等動力學(xué)參數(shù)表現(xiàn)出來的。4)該激活現(xiàn)象源于G4結(jié)構(gòu)誘導(dǎo)Pif1蛋白二聚化。這些反映出G4 DNA對Pif1蛋白快速解救處于停滯狀態(tài)的滯后鏈具有著重要調(diào)控作用。3,利用單分子熒光能量共振轉(zhuǎn)移技術(shù),首次明確Pif1蛋白解旋G4結(jié)構(gòu)的單分子反應(yīng)過程。研究結(jié)果表明:1)ScPif1在單個G4 DNA分子上反復(fù)徘徊,可以重復(fù)將G4結(jié)構(gòu)打開。2)Pif1蛋白解旋單個G4 DNA分子是依順序性分兩步完成的;G-三聯(lián)體結(jié)構(gòu)在上述G4往復(fù)解旋過程中扮演重要的中間體角色。3)根據(jù)以上解旋步驟提出Pif1蛋白解旋G4 DNA的分子機制模型。這些結(jié)果不僅揭示Pif1蛋白如何解旋G4 DNA而且還為G4結(jié)構(gòu)解旋后與自發(fā)再折疊的往復(fù)過程提供大量細(xì)節(jié)。這種新型的往復(fù)穿梭解旋機制意味著Pif1蛋白可以有效解旋那些反復(fù)形成的G4結(jié)構(gòu),為DNA聚合酶順利通過被G4停滯的復(fù)制叉提供機會。綜上所述,本論文綜合運用快速停留熒光檢測,單分子熒光能量共振轉(zhuǎn)移技術(shù)等新穎的分析技術(shù),系統(tǒng)地研究Pif1解旋酶解旋G4 DNA的動力學(xué)特征與單分子機制。這些研究為解旋酶與特定DNA底物作用機理的研究提供經(jīng)驗指導(dǎo),為理解Pif1解旋酶結(jié)構(gòu)與功能相互關(guān)系提供新的理論依據(jù)。
[Abstract]:In this paper , we study the biochemical characteristics and mechanism of Pif1 helicase in vitro . This paper presents a molecular mechanism model of Pif1 protein hydrolysis G4 DNA by means of single molecule fluorescence energy resonance transfer technique .

【學(xué)位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：Q75

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本文編號：1504827