本文關(guān)鍵詞： Pif1解旋酶 G4 DNA 快速停留熒光檢測(cè)技術(shù) 單分子熒光能量共振轉(zhuǎn)移技術(shù) 熒光偏振檢測(cè)技術(shù)　出處：《西北農(nóng)林科技大學(xué)》2015年博士論文　論文類(lèi)型：學(xué)位論文

【摘要】：鳥(niǎo)苷酸-四聯(lián)體結(jié)構(gòu)(G-quadruplex DNA,簡(jiǎn)稱(chēng)G4 DNA)是一種富含鳥(niǎo)苷酸(G)序列的四鏈形態(tài)的DNA二級(jí)結(jié)構(gòu),它在胞體內(nèi)可以發(fā)揮各種各樣的功能,如維持端粒穩(wěn)定,參與DNA復(fù)制起始調(diào)控等。如果解旋G4結(jié)構(gòu)失敗,則會(huì)影響細(xì)胞內(nèi)DNA的正常代謝,導(dǎo)致基因組的不穩(wěn)定。生物體內(nèi)同時(shí)進(jìn)化出解鏈G4結(jié)構(gòu)的解旋酶;其中Pif1解旋酶被證實(shí)在體內(nèi)與體外實(shí)驗(yàn)中都具有很強(qiáng)的解旋G4 DNA的活性。近年來(lái),越來(lái)越多的研究主要在酵母的Sc Pif1與人類(lèi)的hPif1解旋酶的生理生化特征與遺傳學(xué)方面展開(kāi)。但是原核生物Pif1解旋酶的潛在功能和生化特性到目前為止仍然不清楚;ScPif1解旋酶與G4 DNA反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)機(jī)理也尚不明確;而且Pif1蛋白在單分子水平上如何解旋G4結(jié)構(gòu)也是一項(xiàng)亟待解旋的重要課題。本文針對(duì)以上問(wèn)題,分別從以下三個(gè)方面展開(kāi)相關(guān)研究:利用擬桿菌Pif1解旋酶(BsPif1)進(jìn)行原核生物Pif1蛋白的生化特征與動(dòng)力學(xué)機(jī)理的研究;同時(shí),采用快速停留熒光技術(shù)監(jiān)測(cè)重組ScPif1解旋酶解旋含G4結(jié)構(gòu)DNA底物的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)過(guò)程。此外,使用單分子能量共振轉(zhuǎn)移檢測(cè)技術(shù)研究Pif1解旋酶催化G4結(jié)構(gòu)解旋反應(yīng)的分子機(jī)制。這些研究旨在闡明Pif1解旋酶解旋G4 DNA的動(dòng)力學(xué)特征與分子機(jī)制,為深入解析Pif1解旋酶的生理功能提供理論依據(jù)。主要研究成果如下:1,首次系統(tǒng)研究原核生物Pif1解旋酶——BsPif1的生化特征與解旋動(dòng)力學(xué)機(jī)理。研究結(jié)果顯示:1)BsPif1解旋酶以單體形式存在并發(fā)揮功能。2)BsPif1也具有Pif1家族解旋酶的許多共性。3)作為原核生物Pif1解旋酶的代表,BsPif1在解旋底物特異性等多方面與真核生物ScPif1解旋酶之間存在較大差異。4)BsPif1蛋白可以順利解旋G4DNA底物,并具有獨(dú)特的動(dòng)力學(xué)機(jī)理。這些結(jié)果說(shuō)明,Bs Pif1蛋白可以有效的解決在DNA代謝過(guò)程中出現(xiàn)的各類(lèi)問(wèn)題,暗示出該解旋酶可能參與許多重要生理功能。此外,BsPif1在底物特異性與解旋行為模式等方面,都不同于酵母Pif1,而是更類(lèi)似于人類(lèi)Pif1解旋酶。2,在研究ScPif1解旋酶解旋G4 DNA底物的動(dòng)力學(xué)過(guò)程中首次發(fā)現(xiàn)G4 DNA可以極大的增強(qiáng)Pif1蛋白解旋G4結(jié)構(gòu)后雙鏈DNA活性的現(xiàn)象。研究結(jié)果顯示:1)ScPif1蛋白可以高效地解旋含G4結(jié)構(gòu)的雙鏈DNA,并證實(shí)該反應(yīng)依賴(lài)ATP供能。2)G4結(jié)構(gòu)極大地激活Pif1蛋白解旋雙鏈DNA的活性,并且該現(xiàn)象具有其自身結(jié)構(gòu)特點(diǎn);而G3結(jié)構(gòu)卻不能激活Pif1蛋白。3)這種激活效應(yīng)通過(guò)增強(qiáng)解旋速率,解旋步長(zhǎng)及解旋持續(xù)性等動(dòng)力學(xué)參數(shù)表現(xiàn)出來(lái)的。4)該激活現(xiàn)象源于G4結(jié)構(gòu)誘導(dǎo)Pif1蛋白二聚化。這些反映出G4 DNA對(duì)Pif1蛋白快速解救處于停滯狀態(tài)的滯后鏈具有著重要調(diào)控作用。3,利用單分子熒光能量共振轉(zhuǎn)移技術(shù),首次明確Pif1蛋白解旋G4結(jié)構(gòu)的單分子反應(yīng)過(guò)程。研究結(jié)果表明:1)ScPif1在單個(gè)G4 DNA分子上反復(fù)徘徊,可以重復(fù)將G4結(jié)構(gòu)打開(kāi)。2)Pif1蛋白解旋單個(gè)G4 DNA分子是依順序性分兩步完成的;G-三聯(lián)體結(jié)構(gòu)在上述G4往復(fù)解旋過(guò)程中扮演重要的中間體角色。3)根據(jù)以上解旋步驟提出Pif1蛋白解旋G4 DNA的分子機(jī)制模型。這些結(jié)果不僅揭示Pif1蛋白如何解旋G4 DNA而且還為G4結(jié)構(gòu)解旋后與自發(fā)再折疊的往復(fù)過(guò)程提供大量細(xì)節(jié)。這種新型的往復(fù)穿梭解旋機(jī)制意味著Pif1蛋白可以有效解旋那些反復(fù)形成的G4結(jié)構(gòu),為DNA聚合酶順利通過(guò)被G4停滯的復(fù)制叉提供機(jī)會(huì)。綜上所述,本論文綜合運(yùn)用快速停留熒光檢測(cè),單分子熒光能量共振轉(zhuǎn)移技術(shù)等新穎的分析技術(shù),系統(tǒng)地研究Pif1解旋酶解旋G4 DNA的動(dòng)力學(xué)特征與單分子機(jī)制。這些研究為解旋酶與特定DNA底物作用機(jī)理的研究提供經(jīng)驗(yàn)指導(dǎo),為理解Pif1解旋酶結(jié)構(gòu)與功能相互關(guān)系提供新的理論依據(jù)。
[Abstract]:In this paper , we study the biochemical characteristics and mechanism of Pif1 helicase in vitro . This paper presents a molecular mechanism model of Pif1 protein hydrolysis G4 DNA by means of single molecule fluorescence energy resonance transfer technique .

【學(xué)位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類(lèi)號(hào)】：Q75

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本文編號(hào)：1504827