本文關(guān)鍵詞： 多聚半乳糖醛酸酶 熱穩(wěn)定性 T3 loop區(qū) 催化效率 分子動(dòng)力學(xué)模擬　出處：《中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院》2016年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：果膠是一種帶負(fù)電荷的復(fù)雜高分子量多糖,主要存在于陸生植物的細(xì)胞壁中,占植物干重的三分之一。它主要由不同甲酯化程度的半乳糖醛酸以α-1,4糖苷鍵共價(jià)連接而成。由于果膠多糖的復(fù)雜性,其降解需要多種果膠酶共同作用,包括多聚半乳糖醛酸酶、果膠酸裂解酶、鼠李糖聚半乳糖醛酸酶、果膠甲酯酶和果膠乙酰酯酶等。果膠酶廣泛應(yīng)用于果汁、造紙、紡織工業(yè)以及油脂的提取工業(yè)。其中,研究最多、應(yīng)用最廣泛的果膠酶是多聚半乳糖醛酸酶。因此,探究多聚半乳糖醛酸酶結(jié)構(gòu)與功能之間的關(guān)系對(duì)于揭示其催化機(jī)理是非常重要的。本論文從嗜熱真菌Achaetomium sp.Xz8中克隆了一個(gè)內(nèi)切多聚半乳糖醛酸酶的編碼基因PG8fn,并在畢赤酵母中實(shí)現(xiàn)異源表達(dá)。與其他同類酶相比,重組PG8fn的高比活尤其突出:以多聚半乳糖醛酸為底物時(shí)的比活高達(dá)28,122 U/mg,是研究多聚半乳糖醛酸酶分子催化機(jī)制的理想材料。將PG8fn的晶體結(jié)構(gòu)進(jìn)行解析,本文主要對(duì)其結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系展開(kāi)研究�；诶硇栽O(shè)計(jì)的思路探索在酶活不損失的前提下提高酶熱穩(wěn)定性的方法;通過(guò)系統(tǒng)研究活性T3 loop區(qū)上底物結(jié)合位點(diǎn)、二級(jí)結(jié)合位點(diǎn)和非活性位點(diǎn)對(duì)酶催化效率的影響,揭示活性loop區(qū)在酶催化過(guò)程中的作用;以PG8fn T3 loop區(qū)的結(jié)構(gòu)特征指導(dǎo)同類酶分子改良。基于蛋白表面電荷分布優(yōu)化的理性設(shè)計(jì)方法對(duì)PG8fn進(jìn)行熱穩(wěn)定性改良。通過(guò)酶熱穩(wěn)定性系統(tǒng)(ETSS)的計(jì)算結(jié)果,確定了可能與熱穩(wěn)定性相關(guān)的兩個(gè)位點(diǎn)Asp267和Asp322。構(gòu)建單點(diǎn)突變體(D267A和D322R)和組合突變體(D267A/D322R)進(jìn)行表達(dá)和性質(zhì)測(cè)定,并與野生酶PG8fn進(jìn)行比較。三個(gè)突變體的熱穩(wěn)定性都有所提高,提高幅度為D267A/D322RD322RD267A。組合突變體D267A/D322R較野生酶PG8fn的Tmax、T50和Tm值分別提高了10°C、17°C和10.2°C,在50°C和55°C下半衰期分別延長(zhǎng)8.4 h和45 min,而其催化活力與野生酶保持在相當(dāng)?shù)乃?23,000±130 U/mg和28,000±293 U/mg)。分子動(dòng)力學(xué)模擬結(jié)果顯示突變位點(diǎn)Asp267和Asp322可以降低蛋白整體的RMSD值從而導(dǎo)致剛性增強(qiáng)。此研究結(jié)果揭示了表面電荷對(duì)蛋白構(gòu)象穩(wěn)定的重要性,并為蛋白質(zhì)熱穩(wěn)定性改造提供了一個(gè)極為有效的策略。該方法最突出的特點(diǎn)為提高酶熱穩(wěn)定性的同時(shí)不影響酶的催化活性。結(jié)構(gòu)分析顯示PG8fn的活性T3 loop區(qū)上保守殘基Asn117與底物形成氫鍵,本試驗(yàn)探究了該殘基對(duì)酶催化效率的影響。分子動(dòng)力學(xué)模擬分析表明虛擬突變體N117A缺失了117位殘基與底物+1位GalpA O3原子之間的氫鍵而使得底物與活性中心分離,而虛擬突變體N117Q具有更長(zhǎng)的氨基酸側(cè)鏈,導(dǎo)致酶與底物錯(cuò)誤結(jié)合而導(dǎo)致底物逐漸遠(yuǎn)離活性中心。定點(diǎn)突變?cè)囼?yàn)結(jié)果與計(jì)算機(jī)模擬結(jié)果一致,即該位點(diǎn)對(duì)其他氨基酸特別敏感。除了Km值從野生酶PG8fn的0.32增加到0.75 4.74 mg/mL外,所有突變體的kcat下降了3 20,000倍,催化效率下降了8 187,500倍,從而導(dǎo)致△(△G)增加了5.92 33.47 kJ/mol。本試驗(yàn)驗(yàn)證了GH28多聚半乳糖醛酸酶活性T3 loop區(qū)通過(guò)殘基Asn117參與了酶的催化過(guò)程,該保守殘基Asn117對(duì)底物的正確定位使其靠近催化殘基具有重要的作用。PG8fn與已報(bào)道晶體結(jié)構(gòu)的Colletotrichum lupini多聚半乳糖醛酸酶CluPG1(PDB:2IQ7)序列一致性為79.6%,但比活差異一倍。通過(guò)結(jié)構(gòu)比對(duì)發(fā)現(xiàn)兩個(gè)酶催化口袋里的氨基酸高度相似,只有三個(gè)氨基酸殘基差異,其中兩個(gè)分別位于遠(yuǎn)離催化位點(diǎn)的N末端和C末端,另外一個(gè)在PG8fn T3 loop區(qū)上的殘基Lys121,對(duì)應(yīng)CluPG1的Thr。將CluPG1上Thr121突變成Lys后,突變體T121K與底物親和力增大,比活提高到了22,300 U/mg,幾乎達(dá)到了PG8fn的水平,因此殘基Lys121是決定PG8fn具有高比活的關(guān)鍵位點(diǎn)。我們對(duì)其進(jìn)行飽和突變研究,各突變體的Km值和kcat值差異顯著,其中,突變體K121F和K121W的Km值較野生酶PG8fn降低,催化效率較野生酶PG8fn分別提高了44%和105%。分子動(dòng)力學(xué)模擬結(jié)果顯示,位于T3 loop區(qū)上的第121位殘基不僅影響了酶與底物的結(jié)合模式,還直接與底物的-4位GalpA相互作用,屬于多聚半乳糖醛酸酶的底物二級(jí)結(jié)合位點(diǎn)。此研究揭示了PG8fn較同類酶比活高的其中一個(gè)原因是活性T3 loop區(qū)上存在底物二級(jí)結(jié)合位點(diǎn)。在確定了活性T3 loop區(qū)對(duì)酶催化效率的重要影響后,進(jìn)一步研究了T3 loop區(qū)上非活性位點(diǎn)在催化過(guò)程中的作用。根據(jù)PG8fn中獨(dú)特氨基酸組份分析以及靜態(tài)結(jié)構(gòu)的通道識(shí)別,確定了位于T3 loop區(qū)上靠近通道T1的殘基Thr113作為定點(diǎn)突變位點(diǎn)。突變?cè)囼?yàn)結(jié)果顯示各個(gè)酶催化效率從大到小的順序與113位點(diǎn)的氨基酸側(cè)鏈性質(zhì)相關(guān),即帶正電荷氨基酸(Arg、Lys)極性氨基酸(Ser、Gln、Thr)非極性氨基酸(Gly、Ala、Ile)帶負(fù)電荷氨基酸(Glu)。通道分析顯示突變體T113R較野生酶PG8fn通道T2和T3的占據(jù)率和優(yōu)先權(quán)更高。分子動(dòng)力學(xué)模擬結(jié)果表明突變體T113R T3loop區(qū)由于鹽鍵的斷裂而導(dǎo)致柔性增加,繼而影響了酶與底物的結(jié)合。除此之外,殘基Arg113對(duì)催化效率的影響在另一個(gè)多聚半乳糖醛酸酶PG63上得到驗(yàn)證。此研究證實(shí)了活性T3 loop區(qū)上的非活性位點(diǎn)可通過(guò)改變loop區(qū)柔性變化而影響酶催化效率,PG8fn較同類酶比活高的第二個(gè)原因是活性T3 loop區(qū)上存在極性氨基酸的非活性位點(diǎn)�；赑G8fn T3 loop區(qū)上成對(duì)的陽(yáng)離子-π相互作用力這一結(jié)構(gòu)特征,指導(dǎo)PG63進(jìn)行分子改良,并系統(tǒng)研究了陽(yáng)離子-π相互作用力影響催化效率的分子機(jī)理。通過(guò)對(duì)PG63序列和結(jié)構(gòu)分析結(jié)合分子動(dòng)力學(xué)模擬軌跡的陽(yáng)離子-π相互作用力占有率計(jì)算結(jié)果,確定8個(gè)可能在PG63中形成陽(yáng)離子-π相互作用力的位點(diǎn)。其中,引入成對(duì)的陽(yáng)離子-π相互作用力的突變體H58Y較野生酶PG63的催化效率和Tm值分別提高144倍和3.9°C。分子動(dòng)力學(xué)模擬結(jié)果表明位于突變體H58Y T3loop區(qū)上成對(duì)的陽(yáng)離子-π相互作用力(Arg89-Trp90/Arg89-Tyr58)增加了鄰近的T3 loop2上保守殘基His158的剛性,從而很好的指引長(zhǎng)鏈寡糖不斷的向催化口袋里傳送,增加反應(yīng)速率和轉(zhuǎn)換數(shù),從而提高催化效率。此研究證實(shí)了活性T3 loop區(qū)上成對(duì)的陽(yáng)離子-π相互作用力可通過(guò)增加鄰近loop區(qū)上保守殘基His158的剛性而影響酶催化效率,同時(shí),也從側(cè)面證實(shí)了PG8fn較同類酶比活高的第三個(gè)原因是活性T3 loop區(qū)上存在成對(duì)的陽(yáng)離子-π相互作用力。本論文以高比活多聚半乳糖醛酸酶PG8fn為研究對(duì)象,通過(guò)對(duì)蛋白表面電荷分布的優(yōu)化,在酶活無(wú)損失的前提下有效提高了PG8fn的熱穩(wěn)定性,為酶熱穩(wěn)定性改造提供了一種有效策略;系統(tǒng)研究了活性T3 loop區(qū)上底物結(jié)合位點(diǎn)、二級(jí)結(jié)合位點(diǎn)、非活性位點(diǎn)和陽(yáng)離子-π相互作用力對(duì)酶催化效率的影響,揭示了PG8fn具有高比活的分子機(jī)制,為活性loop區(qū)在酶催化反應(yīng)過(guò)程中的功能研究提供了新的視角,具有重要的科學(xué)意義和應(yīng)用價(jià)值。
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【學(xué)位授予單位】：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：Q55
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本文編號(hào)：1502723