本文關(guān)鍵詞： 復(fù)制缺陷型病毒 急性致瘤性ALV v-fps腫瘤基因 v-src腫瘤基因 感染性克隆 致病性和致瘤性 轉(zhuǎn)錄組 拉米夫定　出處：《山東農(nóng)業(yè)大學(xué)》2016年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：近幾年來,我國雞群中J亞群禽白血病病毒(Subgroup J avian leukosis virus,ALV-J)誘發(fā)的髓樣細(xì)胞瘤/血管瘤廣泛流行的同時(shí),在一些蛋雞雞群及“817”肉雜雞雞群中,出現(xiàn)了一定比例的體表纖維肉瘤。人工造病試驗(yàn)表明,接種了肉瘤研磨液的雞在10-14d可發(fā)生相同類型的肉瘤,證明這些肉瘤為急性腫瘤(王鑫等,2012;劉紹瓊等,2012;李傳龍等,2012;李德慶等,2013)。本實(shí)驗(yàn)室前期工作中,以“817”肉雜雞肉瘤組織DNA為模板,擴(kuò)增到五種攜帶不完整v-fps腫瘤基因的缺陷型病毒基因組(Chen et al.,2012)。在此基礎(chǔ)上,本研究將“817”肉雜雞頸部皮下肉瘤和海蘭褐蛋雞腸系膜纖維肉瘤的研磨液接種雞胚成纖維細(xì)胞(chicken embryo fibroblast,CEF),鑒定了兩株急性致瘤性ALV所攜帶的v-fps和v-src腫瘤基因;構(gòu)建了輔助ALV和分別帶有v-fps和v-src腫瘤基因的缺陷型病毒感染性克隆質(zhì)粒,通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)分析拯救病毒的致瘤性;將“817”肉雜雞肉瘤研磨液接種SPF雞,研究了該病毒的致病性和致瘤性;通過雞急性腫瘤的動(dòng)物模型,研究了核苷類抗HIV藥物拉米夫定對(duì)ALV-J復(fù)制的抑制作用。本研究利用反向遺傳學(xué)技術(shù)首次證明了攜帶完整v-fps腫瘤基因的缺陷性ALV可在ALV-J輔助病毒存在的條件下在雞體內(nèi)復(fù)制并誘發(fā)急性纖維肉瘤。同時(shí),該研究也是急性纖維肉瘤天然病例中,攜帶v-src腫瘤基因的ALV-J相關(guān)復(fù)制缺陷型病毒的首次分離報(bào)道。1.“817”肉雜雞急性肉瘤中急性致瘤性病毒的分離及其v-fps腫瘤基因的鑒定將“817”肉雜雞肉瘤研磨液接種1日齡SPF雞,在雞體上傳代。以第五代腫瘤組織DNA和感染了腫瘤研磨液的CEF DNA為模板,通過PCR擴(kuò)增,拼接獲得了缺陷型病毒Fu-J株的前病毒基因組序列。序列分析表明,Fu-J是一株攜帶完整v-fps腫瘤基因的復(fù)制缺陷型病毒,它以復(fù)制型ALV-J SDAU1005為輔助病毒完成自我復(fù)制,故將該病毒懸液命名為Fu-J(SDAU1005)。Fu-J編碼137 kDa的P137gag-fps融合蛋白。使用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)獲得Fps原核蛋白和p19gag原核蛋白,以其制備鼠抗Fps單因子血清和鼠抗p19gag單因子血清。對(duì)感染了Fu-J(SDAU1005)病毒懸液的CEF做IFA和Western blot檢測(cè),結(jié)果表明,感染了Fu-J(SDAU1005)病毒懸液的CEF可以同時(shí)對(duì)ALV-J單克隆抗體、雞抗ALV-J單因子血清和鼠抗Fps單因子血清呈現(xiàn)陽性反應(yīng)。本研究完成了Fu-J株病毒的全基因組序列測(cè)定,為研究該病毒致瘤的分子機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。2.rfu-js感染性克隆的構(gòu)建、病毒拯救和拯救病毒的致瘤性分析通過pcr擴(kuò)增、酶切連接等方法,構(gòu)建了輔助alv感染性克隆質(zhì)粒pmd-sdau1005和六種攜帶不同長(zhǎng)度v-fps腫瘤基因的缺陷型病毒感染性克隆質(zhì)粒pmd-fu-j,pmd-fu-j1,pmd-fu-j2,pmd-fu-j3,pmd-fu-j4和pmd-fu-j5。將pmd-sdau1005和六種pmd-fu-js質(zhì)粒分別按一定比例共轉(zhuǎn)染cef,獲得拯救病毒rfu-j(rsdau1005)、rfu-j1(rsdau1005)、rfu-j2(rsdau1005)、rfu-j3(rsdau1005)、rfu-j4(rsdau1005)和rfu-j5(rsdau1005)。將6種拯救病毒分別翅下接種1日齡spf雞,發(fā)現(xiàn)僅接種rfu-j(rsdau1005)的雞出現(xiàn)了腫瘤(2/10)。將2只雞的腫瘤在1日齡spf雞上持續(xù)傳代。在傳代過程中,腫瘤的生長(zhǎng)速度逐漸加快。當(dāng)傳至第4代時(shí),腫瘤生長(zhǎng)速度與野毒誘發(fā)腫瘤生長(zhǎng)速度基本一致。ifa和免疫組織化學(xué)方法證實(shí)該腫瘤組織對(duì)alv-j及fps抗體呈陽性反應(yīng)。該研究表明,攜帶完整v-fps腫瘤基因的缺陷型alv確實(shí)可誘發(fā)急性腫瘤。3.海蘭褐蛋雞腹腔急性肉瘤中急性致瘤性病毒的分離及其v-src腫瘤基因的鑒定以海蘭褐蛋雞原代腫瘤組織dna和感染了腫瘤研磨液的cefdna為模板,pcr擴(kuò)增獲得了復(fù)制缺陷型病毒sj-1、sj-2、sj-3、sj-4、sj-5及輔助病毒sdau1102的前病毒全基因組序列。該毒株被命名為sj-1(sdau1102)、sj-2(sdau1102)、sj-3(sdau1102)、sj-4(sdau1102)和sj-5(sdau1102)。序列分析表明,輔助病毒sdau1102為j亞群alv,其gp85基因與中國蛋雞分離株js09gy6同源性最高。sj-1~5均攜帶v-src腫瘤基因,它們具有相同的3’端src-env銜接位點(diǎn),但5’端銜接位點(diǎn)差異很大。使用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)獲得p60v-src原核蛋白,以其制備鼠抗p60v-src單因子血清。以該血清為一抗,westernblot和免疫組化實(shí)驗(yàn)顯示,感染了病毒懸液的cef及腫瘤組織中,均存在p60v-src蛋白過表達(dá)。構(gòu)建了五種缺陷型病毒的感染性克隆質(zhì)粒。將其轉(zhuǎn)染cef,發(fā)現(xiàn)僅sj-1和sj-2感染性克隆質(zhì)�？杀磉_(dá)p60v-src蛋白。sj-1~5(sdau1005)的分離及鑒定為為進(jìn)一步研究alv與原癌基因重組和v-src基因致瘤機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。4.fu-j(sdau1005)病毒懸液對(duì)spf雞的致病性和致瘤性研究本研究首先建立了分別針對(duì)alv-jgp85基因和v-fps基因的sybrgreeni實(shí)時(shí)熒光定量pcr方法,兩個(gè)方法特異性好、靈敏度高,為研究fu-j(sdau1005)的復(fù)制動(dòng)態(tài)及其致病性提供了可靠的檢測(cè)方法。分別采用頸部皮下、腹腔和靜脈注射三種方式,將fu-j(sdau1005)病毒懸液接種1日齡spf雞,觀察病毒的致病性和致瘤性。結(jié)果表明,三種接種方式均可誘發(fā)雞的急性腫瘤,且所有腫瘤均為纖維肉瘤;頸部皮下接種組的雞體內(nèi)沒有腫瘤生長(zhǎng),表明該急性腫瘤的轉(zhuǎn)移性不強(qiáng);所有接觸傳播組的雞均未發(fā)現(xiàn)腫瘤生長(zhǎng),表明該急性致瘤性ALV不容易通過橫向接觸方式傳播。從上述結(jié)果,可以推測(cè)疫苗免疫時(shí)重復(fù)使用污染的針頭,可能是某些雞場(chǎng)內(nèi)病毒從一只患病雞傳給其他個(gè)體并發(fā)生急性腫瘤的原因。病毒的抗原定位實(shí)驗(yàn)表明:在發(fā)病雞體內(nèi)腫瘤組織中輔助病毒和缺陷型病毒拷貝數(shù)最高;缺陷型病毒的拷貝數(shù)與輔助病毒拷貝數(shù)存在相關(guān)關(guān)系。5.感染了Fu-J(SDAU1005)病毒懸液的CEF轉(zhuǎn)錄組研究為探討Fu-J株病毒誘發(fā)細(xì)胞轉(zhuǎn)化的機(jī)制,本研究采用基因芯片技術(shù)對(duì)感染了Fu-J(SDAU1005)病毒懸液的CEF轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行了分析。與單獨(dú)感染SDAU1005的CEF相比,感染Fu-J(SDAU1005)病毒懸液的CEF中有1253個(gè)轉(zhuǎn)錄子發(fā)生了4倍及以上的差異表達(dá)。這些差異基因主要涉及細(xì)胞過程、代謝加工、生物學(xué)調(diào)節(jié)、定位和發(fā)育過程等反應(yīng)。細(xì)胞信號(hào)通路分析法發(fā)現(xiàn),這些差異基因主要參與了神經(jīng)活性因子-受體相互作用、緊密連接、代謝信號(hào)通路、GnRH信號(hào)通路、VEGF信號(hào)通路、Wnt信號(hào)通路等。本研究獲得的差異轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)為深入研究v-fps腫瘤基因的急性致瘤機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。6.拉米夫定抑制ALV-J復(fù)制和腫瘤生長(zhǎng)的研究為研究核苷類抗HIV藥物拉米夫定對(duì)ALV-J復(fù)制的抑制作用,首先將Fu-J(SDAU1005)病毒懸液接種體外培養(yǎng)的CEF,研究其對(duì)ALV-J復(fù)制的影響。結(jié)果表明,在1-4μg/ml的濃度范圍內(nèi),拉米夫定可有效抑制輔助ALV和缺陷型病毒的復(fù)制。熒光定量PCR結(jié)果表明,拉米夫定可以抑制ALV反轉(zhuǎn)錄酶的活性。通過雞頸部皮下腫瘤和腹腔腫瘤兩種動(dòng)物模型,研究了拉米夫定在雞體內(nèi)對(duì)ALV-J復(fù)制的抑制作用。結(jié)果表明,拉米夫定可以抑制輔助ALV和缺陷型病毒在雞體內(nèi)的復(fù)制、降低病毒載量,從而減緩雞頸部皮下腫瘤的生長(zhǎng),延長(zhǎng)腹腔攻毒雞的生存時(shí)間并降低其死亡率。本研究為ALV的防控提供了新思路,但拉米夫定能否在雞群中推廣使用尚需進(jìn)一步研究和論證。
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【學(xué)位授予單位】：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S852.65
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本文編號(hào)：1480146