本文關(guān)鍵詞： 豬流行性腹瀉病毒 偽狂犬病毒 氧化石墨烯 抗病毒 二維片狀納米材料　出處：《華中農(nóng)業(yè)大學(xué)》2016年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：由細(xì)菌和病毒引起的傳染病對(duì)人類及動(dòng)物的健康造成了極大的危害,雖然有些傳染病通過疫苗得到了控制,甚至根除,但大部分的傳染病仍未得到很好的控制。不同血清型及毒株之間交叉保護(hù)率弱、新變異毒株不斷出現(xiàn)等使得傳染病的防控愈發(fā)艱難,因此,研究病毒致病機(jī)理及開發(fā)有效的抗病毒制劑對(duì)病毒性疾病的防控和治療有著重要意義。本研究構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)PEDV ORF3的Vero細(xì)胞系,研究ORF3基因?qū)?xì)胞及PEDV病毒復(fù)制的影響,為揭示PEDV的致病機(jī)理提供理論依據(jù)。研究了二維片狀納米材料對(duì)PEDV及PRV的抗病毒作用及其可能的抗病毒機(jī)理,為新型抗病毒材料的研發(fā)提供基礎(chǔ)。具體研究?jī)?nèi)容如下:1.構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)PEDV ORF3的Vero細(xì)胞系,分析ORF3對(duì)細(xì)胞周期、囊泡形成及病毒增殖的影響。通過慢病毒系統(tǒng)獲得穩(wěn)定表達(dá)PEDV ORF3的Vero細(xì)胞系,傳代后仍能穩(wěn)定表達(dá)ORF3。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)Vero及Vero-ORF3的細(xì)胞周期分布發(fā)現(xiàn)Vero-ORF3細(xì)胞中超過40%的細(xì)胞聚集在S期,而在Vero細(xì)胞為28.03%,表明表達(dá)ORF3可延長(zhǎng)Vero細(xì)胞的S期。另一方面,超薄切片可以看出Vero-ORF3中囊泡的數(shù)量明顯多于Vero細(xì)胞及轉(zhuǎn)染截短ORF3的Vero細(xì)胞,并且還在Vero-ORF3細(xì)胞中觀察到雙層膜結(jié)構(gòu)的囊泡,表明ORF3可促進(jìn)細(xì)胞囊泡的形成,與病毒的復(fù)制密切相關(guān)。經(jīng)TCID50及qPCR結(jié)果驗(yàn)證,兩種PEDV弱毒株(AH-M及CV777疫苗株)在Vero-ORF3細(xì)胞上的量均高于Vero細(xì)胞,但強(qiáng)毒株(YN株)卻沒有表現(xiàn)出差異,Western blot結(jié)果也表明Vero-ORF3上PEDV N蛋白表達(dá)量明顯高于Vero細(xì)胞。這些結(jié)果表明ORF3可促進(jìn)PEDV弱毒株的增殖,但對(duì)強(qiáng)毒株沒有影響。2.氧化石墨烯抗病毒研究通過噬斑形成試驗(yàn)、間接免疫熒光及Western blot驗(yàn)證,我們發(fā)現(xiàn)氧化石墨烯納米材料對(duì)偽狂犬病毒(DNA病毒)及豬流行性腹瀉病毒(RNA病毒)均有具有很好的抗病毒效果,并且這種抑制效果具有時(shí)間及劑量依賴效應(yīng)。在病毒感染不同階段加入GO發(fā)現(xiàn)其對(duì)病毒的抑制作用僅發(fā)生在病毒進(jìn)入細(xì)胞之前,表明GO抗病毒作用發(fā)生在細(xì)胞外,很可能為直接接觸發(fā)生的物理作用。為揭示了氧化石墨烯抗病毒機(jī)制,我們比較了GO及rGO抗病毒效果,發(fā)現(xiàn)它們效果一致,表明GO抗病毒作用不依賴于含氧基團(tuán)。通過比較石墨、氧化石墨及GO發(fā)現(xiàn)多層片狀的的氧化石墨抗病毒效果明顯弱于單層結(jié)構(gòu)的GO及rGO,而無定形的石墨不表現(xiàn)抗病毒作用,表明GO獨(dú)特的單層結(jié)構(gòu)對(duì)其抗病毒作用至關(guān)重要。隨后,我們利用陽離子聚合物PDDA與GO復(fù)合,帶正電荷的GO-PDDA復(fù)合物的抗病毒作用消失,而將GO與非離子聚合物PVP結(jié)合后仍帶負(fù)電,保持其抗病毒活性,表明負(fù)電荷也在GO的抗病毒作用中有重要作用,因此我們推測(cè)GO可通過靜電作用與病毒直接接觸,利用其鋒利的邊緣結(jié)構(gòu)破壞病毒結(jié)構(gòu),從而發(fā)揮抗病毒作用。3.類石墨烯材料MoS_2及WS_2抗病毒研究我們還發(fā)現(xiàn)其它二維片狀納米材料二硫化鉬、二硫化鎢也具有良好的抗病毒效果,但與氧化石墨烯相比,其抑制作用降低,并且其細(xì)胞毒性也比GO低。隨后對(duì)MoS_2及GO抗病毒效果進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn),評(píng)價(jià)其體內(nèi)抑制病毒的能力。以豬偽狂犬病毒HNX株(103TCID50)感染Balb/c小鼠,攻毒組小鼠全部死亡,而GO及MoS_2與PRV孵育后攻毒組均有60%小鼠存活;攻毒后靜脈注射GO組小鼠全部死亡,而注射MoS_2組小鼠還有40%小鼠存活。GO+PRV、MoS_2+PRV及MoS_2治療組可對(duì)小鼠提供保護(hù),并且小鼠發(fā)病時(shí)間延后1 d,且小鼠腦組織內(nèi)病毒含量減少,表明MoS_2及GO可抑制PRV在體內(nèi)的增殖,并且在感染后注射MoS_2仍具有保護(hù)效果。4.MoS_2及GO小鼠毒性研究為驗(yàn)證MoS_2及GO的毒性,采取動(dòng)物攻毒實(shí)驗(yàn)中20倍治療劑量(GO為2 mg/kg體重,MoS_2為10 mg/kg體重)靜脈注射小鼠,分別于2、14、60 d取小鼠進(jìn)行組織切片及血液學(xué)檢測(cè),結(jié)果表明小鼠主要實(shí)質(zhì)器官(肺、肝、腎、腦)與對(duì)照組并無差異,未表現(xiàn)實(shí)質(zhì)損傷,血常規(guī)及血清生化檢測(cè)肝、腎功能各項(xiàng)指標(biāo)也未見異常,證明我們實(shí)驗(yàn)濃度下MoS_2及GO對(duì)小鼠并無明顯毒性作用。本研究發(fā)現(xiàn)PEDV ORF3可使細(xì)胞S期延長(zhǎng),并促進(jìn)細(xì)胞囊泡的形成,從而促進(jìn)PEDV弱毒的增殖,為PEDV致病機(jī)理研究提供基礎(chǔ)。我們也首次發(fā)現(xiàn)了二維類石墨烯材料具有優(yōu)越的抗病毒效果,并揭示了其中可能的機(jī)制,為新型抗病毒材料的研發(fā)提供依據(jù)。
[Abstract]:Health caused by bacterial and viral infectious disease to human and animal caused great harm, although some infectious diseases have been controlled by the vaccine, even eradicated, but most of the infectious disease has not been well controlled. Among different serotypes of strains and cross protection was weak, the new variant strains appear such as prevention and control infectious diseases more difficult, therefore, has important significance in prevention and treatment of viral pathogenesis and development of effective antiviral drugs for viral diseases. This study constructs Vero cell line with stable expression of PEDV ORF3, the research of ORF3 gene on the cell and the effect of PEDV virus replication, and provide a theoretical basis for the pathogenesis of PEDV the study of the antiviral effect. Two dimensional sheet of nano materials on PEDV and PRV and its antiviral mechanism may provide a basis for the development of new antiviral material. The concrete research Contents are as follows: 1. to construct a stable expression of PEDV ORF3 in Vero cell line, ORF3 analysis of the cell cycle, effect of vesicle formation and virus proliferation. Vero cells expressing PEDV ORF3 stability by lentiviral system. After passage, the expression is stable ORF3. cell cycle was detected by flow cytometry and Vero Vero-ORF3 distribution Vero-ORF3 more than 40% of the cells in the accumulation of cells in S phase in Vero cells was 28.03%, showed that the expression of ORF3 Vero cells can prolong the period of S. On the other hand, Vero-ORF3 can be seen in thin sections of the number of vesicles was higher than Vero cells and Vero cells transfected with truncated ORF3, and in Vero-ORF3 cells was observed in the double the membrane structure of vesicles, showed that ORF3 can promote the cell vesicle formation, and viral replication is closely related with TCID50 and qPCR. Results show that two kinds of PEDV (AH-M and CV777 attenuated vaccine strain) in Vero-ORF3 cells. The amount was higher than that of Vero cells, but the virulent strain (YN strain) did not show differences, Western blot results indicated that Vero-ORF3 PEDV N expression was significantly higher than that of Vero cells. These results indicate that ORF3 can promote the proliferation of PEDV strain, but the virulent strain.2. did not affect the oxidation of graphene by plaque antiviral research formation test, indirect immunofluorescence and Western blot verification, we found that graphene oxide nano materials of pseudorabies virus (DNA virus) and porcine epidemic diarrhea virus (RNA virus) has good antiviral effect, and the inhibitory effect was dose and time dependent. In different stages of accession to the GO virus infection found inhibition of virus only occurs before the virus enters a cell that GO antiviral effects occur in cells, physical action is likely to occur for direct contact. In order to reveal the graphite oxide Ene antiviral mechanism, we compared GO and rGO antiviral effect, they found the same effect that GO does not depend on the antiviral effect of oxygen containing groups. Through the comparison of graphite, graphite oxide and GO showed that GO and rGO graphite oxide multilayer chip the antiviral effect was weaker than that of monolayer structure, amorphous graphite does not exhibit antiviral effect showed that the unique structure of GO is crucial to its antiviral effect. Then, we use PDDA and GO cationic polymer composite, the antiviral effect of GO-PDDA complexes disappeared with a positive charge, while the GO and PVP combined with nonionic polymers still negatively charged, maintain its antiviral activity, showed that the negative charge also plays an important role in the antiviral effect of GO, so we speculate that GO can contact directly through the electrostatic interaction with the virus, the virus destroyed the structure of sharp edge structure, so as to exert antiviral Use the.3. class of graphene materials MoS_2 and WS_2 antiviral research we also found other two-dimensional nano sheet material MoS2, two tungsten sulfide also has good antiviral effect, but compared with the graphene oxide, reduce the inhibitory effect, and its toxicity is lower than that of GO. Then the animal experiments were carried out on MoS_2 and GO antiviral effect, ability to evaluate the in vivo inhibition of virus. The pseudorabies virus HNX strain (103TCID50) infection in Balb/c mice challenged mice all died, while GO and MoS_2 were incubated with PRV survival after vaccination group had 60% mice; after infection of intravenous injection of GO mice all died, and the injection of MoS_2 mice and 40% mice the survival of.GO+PRV, MoS_2+PRV and MoS_2 group can provide protection to the mice, and the onset time of mice by 1 D, and the virus content in the brain tissue of mice decreased, indicates that MoS_2 and GO can inhibit the proliferation of PRV in vivo, and After infection of MoS_2 injection has protective effect of.4.MoS_2 and GO mice in order to verify MoS_2 and GO toxicity, take animal poison attack experiment 20 times the therapeutic dose (GO 2 mg/kg MoS_2 weight, 10 mg/kg body weight) intravenous injection in mice, 2,14,60 D mice were detected by histological section and blood. The results showed that mice mainly parenchymatous organs (lung, liver, kidney, brain) and there is no difference between the control group and did not show substantial damage, blood routine and serum biochemical detection of liver and kidney function indexes is no exception, and we prove that GO MoS_2 experimental concentration has no obvious toxic effect on mice. The study found that PEDV ORF3 can make the cell the S period is prolonged, and promotes cell vesicle formation, thereby promoting PEDV attenuated the proliferation, provide the basis for the study of pathogenic mechanism of PEDV. We have also found superior antiviral effect of two-dimensional graphene material has, and exposing the The possible mechanisms are shown to provide a basis for the development of new antiviral materials.

【學(xué)位授予單位】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S852.65

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本文編號(hào)：1454361