發(fā)布時(shí)間：2018-01-19 14:46

  本文關(guān)鍵詞： 胚胎發(fā)育 花器官發(fā)育 ZIX SAP 蛋白降解　出處：《中國農(nóng)業(yè)大學(xué)》2017年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：顯花植物的花包含雌蕊和雄蕊兩種生殖器官,分別產(chǎn)生雌、雄配子體。開花時(shí),在雄蕊的花藥中所產(chǎn)生的雄配子體(花粉)被釋放和傳遞到雌蕊的柱頭上,經(jīng)過水合萌發(fā)出花粉管,經(jīng)引導(dǎo)組織最后進(jìn)入胚珠中的雌配子體(胚囊)并釋放所攜帶的兩個(gè)精細(xì)胞,分別與卵細(xì)胞和中央細(xì)胞融合完成雙受精作用。卵細(xì)胞授精后形成的合子發(fā)育成胚胎,并進(jìn)一步發(fā)育成一棵植物。因此,花的發(fā)育以及胚胎的發(fā)育對于植物完成世代交替至關(guān)重要,是植物生產(chǎn)種子進(jìn)行繁衍的基礎(chǔ),與農(nóng)業(yè)生產(chǎn)密切相關(guān)。研究花及胚胎發(fā)育的分子遺傳機(jī)制不僅可以了解花發(fā)育和胚胎發(fā)育的遺傳機(jī)制,也可為農(nóng)作物栽培和育種提供理論參考。我們研究組在前期的研究工作中,分離鑒定到了兩個(gè)由Ds轉(zhuǎn)座子插入產(chǎn)生的胚胎發(fā)育缺陷突變體kd616和sgt4712。分子生物學(xué)分析顯示,這兩個(gè)突變體中的Ds元件都插入在同一個(gè)編碼Armadillo蛋白的基因AT4G00231中。最近,AT4G00231被命名為Z4A IXIK(ZIX),因此我們把kd616和sgt4712分別改名為zix-1和zix-4。遺傳和表型分析顯示,這兩個(gè)突變體都不影響雌、雄配子體的形成與發(fā)育,但嚴(yán)重影響胚胎的發(fā)育,造成胚胎發(fā)育停滯在球形胚時(shí)期,導(dǎo)致種子敗育,不能產(chǎn)生純合突變體植株。本論文是在原有研究進(jìn)展的基礎(chǔ)上進(jìn)一步分析鑒定了 zix-1和zix-4突變體及ZIX的功能和作用機(jī)制。表達(dá)模式分析結(jié)果顯示,ZIX是一個(gè)組成型表達(dá)的基因,在分裂旺盛的組織中有較高表達(dá),暗示它可能在除了胚胎以外的其它植物組織也起作用。因此,利用胚胎特異表達(dá)基因ABI3的啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)ZIX基因在zix-1中表達(dá)進(jìn)行胚胎拯救實(shí)驗(yàn),構(gòu)建了由胚胎拯救所獲得的純合zix突變體系EmR-zix-1。EmR-zix-1突變體植株表現(xiàn)出嚴(yán)重的多樣性生長發(fā)育缺陷,主要表現(xiàn)為:植株生長矮小不能開花;或植株生長正常能開花,但花器官發(fā)育出現(xiàn)嚴(yán)重缺陷,包括花瓣殘缺或缺失、雄蕊數(shù)目和發(fā)育異常、花藥藥室發(fā)育缺陷、雌蕊頂部融合缺陷及心皮不融合、胚珠裸露等。用EmR-zix-1植株花序?yàn)椴牧线M(jìn)行RNAseq分析顯示,ZIX基因突變會(huì)影響很多基因的表達(dá),包括與細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、氧化還原反應(yīng)、物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)、脅迫響應(yīng)和代謝等方面相關(guān)的基因。與野生型相比,EmR-zix-1植株中,一些與花器官發(fā)育相關(guān)基因的表達(dá)受到了顯著的影響。而在一些花發(fā)育同源異型基因突變體中,ZIX基因的表達(dá)量也發(fā)生變化。這些研究結(jié)果顯示,ZIX除了對胚胎發(fā)育至關(guān)重要外,在花發(fā)育中也起重要作用。ZIX基因編碼一個(gè)54 kD的含475個(gè)氨基酸的Armadillo(ARM)蛋白。該蛋白與其它物種中的Arm蛋白相似性較低,但其C末端有一個(gè)保守的Ataxin10同型結(jié)構(gòu)域。預(yù)測其高級結(jié)構(gòu)為典型的右手超螺旋的螺線管結(jié)構(gòu)。結(jié)構(gòu)分析顯示ZIX蛋白可能形成同源聚合體,并通過結(jié)合生物大分子如DNA或者蛋白質(zhì)發(fā)揮作用。BiFC、LCI、pull-down和Native PAGE實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示,ZIX蛋白能夠形成同源聚合體。利用串聯(lián)親和純化的方法進(jìn)行免疫沉淀分析,獲得了一個(gè)與ZIX互作的候選蛋白SAP。進(jìn)一步的pull-down、BiFC、LCI和Co-IP實(shí)驗(yàn)也證明了 ZIX能夠與SAP相互作用。ZIX和SAP蛋白的亞細(xì)胞定位結(jié)果顯示ZIX蛋白定位于胞質(zhì)和細(xì)胞核內(nèi),SAP蛋白定位于細(xì)胞核內(nèi),說明它們的亞細(xì)胞定位具有一定的重疊性。表達(dá)模式分析發(fā)現(xiàn),SAP基因也在擬南芥多個(gè)組織中表達(dá),特別是在花序和角果中高表達(dá),這與ZIX基因的表達(dá)位置也具有重疊性。此外,利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)構(gòu)建的cas9-sap-92純合突變體和從Kaufmann實(shí)驗(yàn)室獲得的sap-flag/-進(jìn)行表型比較分析的結(jié)果顯示,這些純合sap突變體在花發(fā)育方面具有與胚胎拯救zix突變體(EmR-zix-1)相似的表型,如:花瓣殘缺或缺失、雄蕊的數(shù)目和發(fā)育異常和部分雌蕊心皮不融合等。但是這些sap突變體沒有胚胎缺陷的表型,不同于具有胚胎發(fā)育缺陷導(dǎo)致種子敗育表型的ziix突變體。這些結(jié)果顯示,ZIX可能是通過與SAP互作在花發(fā)育中起重要作用,但不清楚SAP是否也與胚胎發(fā)育相關(guān)。轉(zhuǎn)錄激活試驗(yàn)結(jié)果顯示,ZIX-BD融合蛋白在酵母中具有轉(zhuǎn)錄激活活性,暗示ZIX可能具有激活基因轉(zhuǎn)錄的功能。Cell free降解實(shí)驗(yàn)顯示,ZIX蛋白在體外不穩(wěn)定,并且這種不穩(wěn)定性能夠被蛋白酶抑制劑MG132抑制,推測該蛋白可能經(jīng)26S蛋白酶體途徑降解。分別利用從S4P過表達(dá)、突變體和野生型植株中提取的總蛋白處理體外純化的GST-ZIX蛋白進(jìn)行降解試驗(yàn),發(fā)現(xiàn)來自突變體中的總蛋白提取液不能促進(jìn)GST-ZIX的降解,而來自過表達(dá)材料的總蛋白提取液與來自野生型植株的一樣,能促進(jìn)GST-ZIX的降解。在S4P過表達(dá)和sap突變體植株中,ZIX基因的表達(dá)量與野生型中的相比沒有明顯差異。在SAP過表達(dá)植株中,ZIX蛋白的含量與野生型的相比也沒有差異,但在sap突變體植株內(nèi)有所升高。這些結(jié)果表明,ZIX可能是SAP的一個(gè)靶標(biāo)蛋白,SAP可能通過調(diào)節(jié)ZIX蛋白的降解,從而調(diào)控下游基因的表達(dá)。綜上所述,ZIX基因不但對胚胎發(fā)育至關(guān)重要,而且還通過與SAP互作在花的發(fā)育中起重要作用。這些研究結(jié)果為了解胚胎和花發(fā)育的遺傳機(jī)制提供新的線索,對認(rèn)知Armadillo蛋白基因在植物發(fā)育中的作用也具有重要意義。
[Abstract]:In this paper , the development of pollen and the development of embryonic development are very important to the development of plants . These two mutants have been named Z4A IXIK ( ZIX ) . The results of these studies show that the ZIX protein can form homologous polymer . The results of these studies show that the ZIX protein can form homologous polymer . The results of these studies show that ZIX protein can form homologous polymer . The results show that the ZIX protein can form homologous polymer .

【學(xué)位授予單位】：中國農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：Q943.2

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前3條

1 José Fernndez Gmez;Behzad Talle;Zoe A Wilson;;Anther and pollen development:A conserved developmental pathway[J];Journal of Integrative Plant Biology;2015年11期

2 ;A Genetic Pathway for Tapetum Development and Function in Arabidopsis[J];Journal of Integrative Plant Biology;2011年11期

3 ;AtMYB103 is a crucial regulator of several pathways affecting Arabidopsis anther development[J];Science China(Life Sciences);2010年09期

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本文編號(hào)：1444648