本文關(guān)鍵詞：豬戊型肝炎病毒抗原性及諾如病毒與宿主蛋白互作的研究　出處：《西北農(nóng)林科技大學(xué)》2017年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：本課題研究涉及戊型肝炎病毒和諾如病毒,兩種病毒在病毒結(jié)構(gòu)及其傳染危害上有一定相似性。二者均為單股正鏈RNA二十面體病毒,都感染人及其它動物種屬,病毒傳播重要途徑之一是糞口傳播,前期都因無高效體外培養(yǎng)系統(tǒng)阻礙對病毒感染復(fù)制機(jī)理的研究。兩種病毒在研究思路及方法上有很多可相互借鑒之處。第一部分豬戊型肝炎病毒戊型肝炎(Hepatitis E)由戊型肝炎病毒(Hepatitis E virus,HEV)感染引起的一種傳染性自限性肝炎。全球每年約有2000萬人被HEV感染,導(dǎo)致約5.66萬人死亡。哺乳動物HEV包括HEV-1到HEV-7七個亞型,其中HEV-3和HEV-4具有人畜共感染性,其可感染人、豬和兔等物種。豬是人畜共患HEV的主要儲存庫,在全球豬群內(nèi)HEV抗體均呈現(xiàn)高陽性率(46%-100%)。實驗證實豬HEV-3和HEV-4可以感染靈長類動物恒河猴,且在日本、法國、德國、西班牙和澳大利亞等人戊型肝炎散發(fā)案例表明:人HEV的感染與直接食用未煮熟的豬HEV污染的豬肉及臟器食品有關(guān)。基于豬HEV的人畜共患傳播風(fēng)險,本課題分離鑒定了山東地區(qū)豬HEV的流行毒株并對該地區(qū)豬群中HEV流行情況進(jìn)行了調(diào)查。HEV衣殼蛋白包含病毒顆粒主要抗原表位,能夠誘導(dǎo)體液免疫應(yīng)答。對衣殼蛋白抗原結(jié)構(gòu)精細(xì)化鑒定有利于促進(jìn)血清診斷和疫苗的研發(fā)。研究證實,禽HEV衣殼蛋白中抗原區(qū)I(aa 389-410)中存在一個禽、人和豬HEV共有表位。但后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)豬和人的抗HEV陽性血清能與不含抗原區(qū)I的禽HEV重組蛋白交叉反應(yīng),這表明還存在其它禽、人和豬HEV共有抗原表位。本課題精確鑒定了不同物種HEV共有抗原表位,加深了對HEV衣殼蛋白的抗原結(jié)構(gòu)了解,并且對于開發(fā)HEV的血清診斷和疫苗設(shè)計有一定借鑒意義。1.山東地區(qū)豬戊型肝炎病毒基因組序列特征分析及感染率調(diào)查在本研究中,利用HEV ORF2部分基因建立的RT-n PCR方法檢測了來自中國山東省屠宰場的106份膽汁樣品中HEV RNA;利用間接ELISA方法對山東地區(qū)24個養(yǎng)殖場980豬血清樣品中的抗豬HEV Ig M和Ig G特異性抗體陽性率進(jìn)行了調(diào)查。研究發(fā)現(xiàn)106份膽汁樣品中32份是HEV RNA陽性(30.2%),從樣品中檢測到20個不同同源性(86.8-100%)的ORF2片段序列。進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn)這些病毒序列屬于基因4型HEV的4a和4d亞型。同時測定了一株4d亞型豬HEV毒株。對山東24個地區(qū)豬群中抗HEV抗體檢測發(fā)現(xiàn),不同地區(qū)Ig G和Ig M血清陽性率分別為100%(24/24)和41.7%(10/24),對豬個體陽性率分析,發(fā)現(xiàn)Ig G和Ig M的陽性率分別為69.4%(651/980)和1.6%(16/980)。結(jié)果表明,在山東地區(qū)豬養(yǎng)殖場和屠宰場中,基因4型HEV普遍流行,這對公共衛(wèi)生安全是巨大挑戰(zhàn),應(yīng)加強防護(hù)及安全保護(hù)措施。2.兩個戊型肝炎病毒共有抗原表位的鑒定本研究發(fā)現(xiàn),由禽HEV衣殼蛋白制備的單克隆抗體(MAb)3E8和1B5能與豬HEV衣殼蛋白發(fā)生交叉反應(yīng),暗示這兩株抗體可能識別禽和豬HEV共有抗原表位。利用生物淘選、多肽合成、截短或突變的重組蛋白表達(dá),綜合利用ELISA和Western blot方法來鑒定和驗證兩株單克隆抗體所識別的抗原表位。結(jié)果發(fā)現(xiàn),3E8表位核心區(qū)為I/VPHD,其中P和H是關(guān)鍵氨基酸;1B5表位為VKLYM/TS。兩抗原表位在不同種屬HEV衣殼蛋白序列中高度保守,推測它們可能也是野豬、兔、大鼠、雪貂、貓鼬、鹿和駱駝HEV的共有抗原表位。蛋白三維模型分析發(fā)現(xiàn)兩個表位至少部分暴露于HEV病毒顆粒表面,推測其可能有中和活性,但中和保護(hù)性實驗發(fā)現(xiàn)3E8和1B5表位對雞沒有保護(hù)作用。本研究鑒定了人、豬和禽HEVs衣殼蛋白上兩個共有抗原表位,對了解HEV衣殼蛋白抗原結(jié)構(gòu)和開發(fā)診斷試劑有推動作用。第二部分諾如病毒與宿主蛋白互作的研究諾如病毒(Hu No V)屬單股正鏈RNA病毒,是引起人急性胃腸炎的主要病原。全球每年約20萬人因Hu No V感染死亡,造成巨大經(jīng)濟(jì)損失。由于缺乏高效Hu No V體外培養(yǎng)系統(tǒng),嚴(yán)重延緩了對病毒感染復(fù)制機(jī)理的研究。鼠諾如病毒(MNV)與Hu No V遺傳關(guān)系密切,是研究諾如病毒感染復(fù)制機(jī)理的理想模型。VPg蛋白在病毒基因組復(fù)制、病毒蛋白翻譯及抑制宿主細(xì)胞抗病毒反應(yīng)等方面發(fā)揮重要作用,是構(gòu)成具有感染性的RNA所必須的組分。VP2蛋白是由ORF3編碼的次衣殼蛋白,參與病毒組裝并能增強20面體病毒顆粒的穩(wěn)定性,是形成具有感染性病毒的必要組分。但目前對宿主細(xì)胞中參與及輔助VPg及VP2蛋白功能及代謝過程的宿主蛋白尚不清楚,為此我們利用MNV模型,開展鑒定與諾如病毒VPg和VP2蛋白相互作用的宿主細(xì)胞蛋白及其功能的研究。1.宿主細(xì)胞與諾如病毒VPg相互作用蛋白的鑒定本研究中,我們利用基于同位素標(biāo)記(SILAC)的免疫共沉淀及質(zhì)譜檢測方法來鑒定宿主細(xì)胞中與MNV和Hu No V VPg相互作用蛋白。MNV VPg IP質(zhì)譜實驗檢測到91個陽性宿主蛋白,其中37個蛋白會因F123A突變喪失與VPg互作能力。同樣,Hu No V質(zhì)譜數(shù)據(jù)顯示95個宿主蛋白可能與WT VPg互作,同時F137A的突變導(dǎo)致12個蛋白不再結(jié)合。對MNV和Hu No V互作蛋白數(shù)據(jù)的共同分析發(fā)現(xiàn),包括e IF3和e IF4F轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物(e IF3A、e IF4G1和e IF4E等)及G3BP1和YBX1在內(nèi)的48個宿主蛋白與二者均有較強結(jié)合能力。其中,在鑒定的靶蛋白中包括已被證實與VPg相互作用的e IF4G1和e IF4E蛋白,證明SILAC GFP親和純化實驗的可信性�；谇捌谘芯勘尘�,我們優(yōu)先驗證YBX1與G3BP1與VPg的相互作用,進(jìn)而探究其在諾如病毒感染宿主細(xì)胞中參與的代謝過程及機(jī)理。2.鼠諾如病毒VP2蛋白與宿主細(xì)胞互作蛋白的鑒定為了探究MNV感染宿主細(xì)胞過程中與VP2蛋白相互作用的宿主細(xì)胞蛋白及其作用機(jī)理,本研究利用帶有FLAG標(biāo)簽的重組MNV以及基于SILAC標(biāo)記的定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù),探究了MNV感染中參與VP2功能代謝的宿主蛋白。通過分析比較野生型病毒感染的陰性對照組與VP2-FLAG MNV感染的實驗組IP樣品質(zhì)譜數(shù)據(jù),共發(fā)現(xiàn)51種互作蛋白。其中,與VP2互作相關(guān)復(fù)合物,包含病毒非結(jié)構(gòu)蛋白Ns1/2,Ns3,Ns4和VF1以及主要衣殼蛋白VP1。除此之外,在鑒定的宿主細(xì)胞蛋白中發(fā)現(xiàn)了已被證實為MNV受體的CD300lf蛋白以及在SV40病毒從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)遷移到細(xì)胞質(zhì)過程中的關(guān)鍵輔助蛋白BAP29,BAP31和Bip等。上述結(jié)果證明了本研究方案的有效性及結(jié)果的可信性,同時暗示其中的一些靶蛋白可能與VP2協(xié)同發(fā)揮作用參與了諾如病毒的感染過程。
[Abstract]:HEV ( HEV - 3 ) and HEV - 4 ( HEV - 4 ) have a high positive rate ( 46 % -100 % ) . In this study , we found that the two epitopes of virus ( Hu No V ) could be used to identify and verify the replication mechanism of HEV . The results showed that the two epitopes of the virus and host protein were highly conserved in the human , rabbit , rat , ferret , ferret , deer and camel HEV . In this study , we identified 51 species of interacting proteins , including e IF3 and e IF4F transcription initiation complexes ( e IF3A , e IF4G1 and e IF4E , etc . ) and G3BP1 and YBX1 .

【學(xué)位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：S852.651
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本文編號：1437741