本文關(guān)鍵詞：花生ABA途徑抗逆基因AhLOS5克隆與抗逆性研究　出處：《山東農(nóng)業(yè)大學(xué)》2017年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：花生(Arachis hypogaea L.)是我國重要的油料作物和經(jīng)濟作物,以其扎根深、開花量大、花期長、無明顯的需水臨界期以及水分利用率較高等特點,具有較強的抗旱性,是發(fā)展旱作農(nóng)業(yè)和旱薄地開發(fā)的理想作物。干旱往往伴隨土壤荒漠化、鹽漬化的加重,給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)帶來多種因素的制約。在全球范圍內(nèi),有2/3的花生分布在旱作地區(qū),缺少灌溉條件加之瘠薄的砂質(zhì)土壤,使干旱和高鹽危害非常普遍,已成為花生生產(chǎn)上分布最廣、危害程度最大的限制因素。在我國,常年有70%的花生遭受不同程度的干旱和高鹽脅迫,干旱和高鹽引起的莢果減產(chǎn)率平均在20%以上。植物對非生物逆境的響應(yīng)伴隨著對生長發(fā)育過程很多基因的調(diào)控。植物激素脫落酸(abscisic acid,ABA)能參與植物對許多環(huán)境脅迫如干旱、冷害、鹽害等的生理反應(yīng)和分子生物學(xué)效應(yīng)。目前ABA已經(jīng)公認(rèn)為能夠誘導(dǎo)植物產(chǎn)生對不良環(huán)境的抗性(抗旱性、抗寒性、抗病性、耐鹽性等),是植物的“抗逆誘導(dǎo)因子”。目前公認(rèn)的高等植物體內(nèi)的ABA的生物合成主要為間接途徑,反應(yīng)過程中的玉米黃質(zhì)環(huán)氧化酶(ZEP)、9-順式環(huán)氧類胡蘿卜素雙加氧酶(NCED)、ABA醛氧化酶(AAO)及鉬輔因子硫化酶(MCSU)是關(guān)鍵調(diào)控酶。本研究從花生栽培品種‘豐花1號’中克隆了鉬輔因子硫酸化酶基因AhLOS5,進行了抗逆性鑒定和基因功能驗證。構(gòu)建了含AhLOS5基因的正義和反義植物表達(dá)載體,農(nóng)桿菌介導(dǎo)分別轉(zhuǎn)化三生煙草,獲得了不同AhLOS5表達(dá)水平的轉(zhuǎn)基因煙草植株,并對這些轉(zhuǎn)基因株系的T1代植株進行了生物學(xué)功能分析。通過生理分析、遺傳鑒定、分子生物學(xué)和生物化學(xué)的研究確定AhLOS5應(yīng)答非生物逆境的機制。具體結(jié)果如下:(1)選取了黃淮�；ㄉa(chǎn)區(qū)4個主推品種,進行抗旱性鑒定�？购敌阅芘琶麨椤ㄓ�20號’‘豐花1號’‘海花1號’‘白沙1016’。(2)在黃淮海花生主產(chǎn)區(qū)種植面積較大,同時表現(xiàn)高抗旱性的花生品種‘豐花1號’中成功克隆花生AhLOS5基因。全長2731個堿基,包括2451bp的開放閱讀框,115bp的5′非編碼區(qū),165bp的3′非編碼區(qū),ORF編碼816個氨基酸。該基因編碼鉬輔因子硫酸化酶,屬于MOSC超家族。同源性分析證明,我們克隆得到的‘豐花1號’AhLOS5與花生二倍體野生種A.duranensis中的AdLOS5同源性最高,達(dá)到94.7%,與AiLOS5同源性為92.2%。與其他高等植物相比,AhLOS5與同屬豆科的狹葉羽扇豆、矮沙冬青、木豆、同源性較高,分別為77.7%、73.7%和72.9%,與屬十字花科的擬南芥同源性略低,為59.9%。(3)以AhLOS5 cDNA核苷酸片段制備探針對4個主推品種中AhLOS5的表達(dá)特性進行了分析。結(jié)果顯示,AhLOS5在4個主推品種中表達(dá)量順序為‘花育20號’‘豐花1號’‘�；�1號’‘白沙1016’。我們發(fā)現(xiàn),4個品種間的AhLOS5基因表達(dá)量排序與其抗旱性排序一致。驗證了該基因在花生中的抗旱性。(4)采用Northern雜交的方法對‘豐花1號’中AhLOS5的表達(dá)特性進行了分析。結(jié)果表明,AhLOS5在花生中組成型表達(dá),花生各器官中表達(dá)量順序為花成熟葉幼果果針根莖,在葉片中的表達(dá)量隨著葉齡的增加而增加,在葉片展開第50d達(dá)到峰值。AhLOS5的表達(dá)還受干旱和鹽脅迫誘導(dǎo),誘導(dǎo)作用明顯。(5)構(gòu)建了2種植物表達(dá)載體,即含正義AhLOS5的載體pBI-LOS5和含反義AhLOS5的載體pBI-R-LOS5。以三生煙草為轉(zhuǎn)化受體,采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法,將上述2種載體分別轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)不同載體的轉(zhuǎn)基因煙草當(dāng)代(T0代)所結(jié)的種子,經(jīng)卡那霉素篩選,并結(jié)合轉(zhuǎn)基因株系的T1代植株P(guān)CR鑒定結(jié)果,初步確定,含反義AhLOS5的轉(zhuǎn)基因植株有20株,含正義AhLOS5的轉(zhuǎn)基因植株有52株,并選取部分不同類型的轉(zhuǎn)基因植株進行了Northern雜交分析。(6)通過轉(zhuǎn)基因煙草植株種子根長、葉綠素含量、相對含水量、相對電導(dǎo)率、丙二醛(MDA)、抗壞血酸(ASA)、抗氧化酶活性(SOD,POD,CAT,APX)、內(nèi)源ABA、脯氨酸等生理生化指標(biāo)檢測發(fā)現(xiàn),在干旱和鹽脅迫下,過表達(dá)AhLOS5的轉(zhuǎn)基因煙草轉(zhuǎn)基因植株體內(nèi)內(nèi)源ABA含量顯著升高,抗氧化酶活性明顯升高,膜脂完整性好,滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量高。過表達(dá)AhLOS5能夠明顯的提高轉(zhuǎn)基因株系對干旱和鹽脅迫的抗性。(7)用Northern blot方法對轉(zhuǎn)基因煙草中另外3個抗逆相關(guān)基因DREB2B,RD22,P5CS表達(dá)進行檢測。結(jié)果顯示,在干旱和鹽脅迫下,正義轉(zhuǎn)基因和野生型對照植株的3個基因DREB2B,RD22,P5CS都誘導(dǎo)表達(dá);而反義轉(zhuǎn)基因植株中只有不依賴ABA的抗逆基因DREB2B誘導(dǎo)表達(dá),依賴ABA的抗逆基因RD22和P5CS都不誘導(dǎo)表達(dá)。這證明了AhLOS5參與的植物抗逆途徑屬于依賴ABA途徑,過表達(dá)AhLOS5轉(zhuǎn)基因煙草獲得的抗逆性是由脅迫誘導(dǎo)產(chǎn)生的內(nèi)源ABA調(diào)控的。
[Abstract]:Peanut (Arachis hypogaea L.) is China's important oil crops and economic crops, with its deep rooted flowering, large quantity, long flowering period, no obvious characteristics of a higher rate of using the critical period of water requirement and water, has strong drought resistance, is the ideal development of dryland agriculture and dryland crops drought development. Often accompanied by soil desertification, salinization of agricultural production increase, to bring a variety of factors. In the global scope, the 2/3 distribution in peanut dry farming area, lack of sandy soil and irrigation conditions in the barren, drought and high salt harm is common, has become the most widely distributed peanut production, the largest limiting factors of hazards. In our country, there are 70% perennial peanut suffered varying degrees of drought and high salt stress, drought and high salt induced pod yield reduction rate of 20% on average. The plant response to abiotic stress along with the growth of During the development of regulation of many genes. The plant hormone abscisic acid (abscisic acid, ABA) can participate in many plants to environmental stresses such as drought, chilling injury, physiological and molecular responses of salt damage and so on. At present ABA has been recognized as to induce resistance to the adverse environment (drought resistance, cold resistance, disease resistance. The salt tolerance of plants, etc.) is the "resistance inducing factor". The biosynthesis recognized in higher plants ABA mainly indirectly in the reaction process of zeaxanthin epoxidase (ZEP), 9- CIS epoxy carotenoid dioxygenase (NCED), ABA aldehyde oxidase (AAO) and the molybdenum cofactor sulfurase (MCSU) is a key regulatory enzyme. This study from the peanut cultivar "Fenghua 1" cloned molybdenum cofactor sulfurylase gene AhLOS5, the resistance identification and gene function. The construct containing AhLOS5 gene and anti justice Antisense plant expression vector and Agrobacterium mediated transformation respectively three tobacco, obtained a different AhLOS5 expression level in transgenic tobacco plants, and the transgenic plants of the T1 generation of biological function analysis, genetic identification by physiology, biochemistry and molecular biology research to determine the mechanism of non biological stress response AhLOS5. The main results are as follows: (1) the flower production area of Huanghuaihai 4 main varieties, the drought resistance of drought resistance identification. Ranking as "Huayu 20" and "Fenghua 1" Haihua No. 1 "and" 1016 white ". (2) in the larger planting peanut production area of Huanghuaihai area. At the same time high drought resistance of peanut varieties" Fenghua 1 "in the successful cloning of AhLOS5 gene from peanut. A total length of 2731 nucleotides, including an open reading frame of 2451bp, 115bp 5 '- 3' of the 165bp encoding region, non encoding region of ORF encoding 816 amino acids. The gene encoding molybdenum cofactor sulfurylase, belonging to the MOSC superfamily. Homology analysis, we cloned the "Fenghua 1" AhLOS5 and peanut wild diploid species in A.duranensis AdLOS5 the highest homology reached 94.7%, compared to 92.2%. and AiLOS5 homology with other higher plants, and AhLOS5 belong to the legume narrow leaved lupine, Ammopiptanthus nanus, Dal, homology, respectively 77.7%, 73.7% and 72.9% homology with the Arabidopsis Cruciferae family of slightly lower, 59.9%. (3) to AhLOS5 cDNA nucleotide fragment probe preparation was analyzed in 4 main varieties in the expression of AhLOS5 were investigated. According to AhLOS5, in the 4 main varieties in order for the expression of "Huayu 20" and "Fenghua 1" Haihua No. 1 "Baisha 1016 '. We found that the AhLOS5 gene, 4 varieties of drought resistance and expression of sort order is the same. The validation of the gene Drought resistance in peanut. (4) using the method of Northern hybridization analyses' chongban expression characteristics of No. 1 "in AhLOS5. The results showed that the expression of AhLOS5 in peanut constitutively expressed in various organs of peanut order flowers mature leaves of young fruit needle roots, the expression in leaves and increased with the age increasing, the expression of 50D in leaf expansion reached the peak of.AhLOS5 is also affected by drought and salt stress induced induced obviously. (5) constructed 2 plant expression vector, the vector pBI-LOS5 containing AhLOS5 and justice containing antisense AhLOS5 vector pBI-R-LOS5. to three tobacco transformation, using the method of agricultural Agrobacterium mediated, the 2 vectors were transformed into different carriers. Contemporary transgenic tobacco (T0 generation) with seeds selected by kanamycin, preliminary determination combined with transgenic T1 plants PCR identification results, containing antisense AhL There were 20 strains of OS5 transgenic plants, transgenic plants containing just 52 strains were AhLOS5, and selected parts of the different types of transgenic plants were analyzed by Northern blot analysis. (6) by transgenic tobacco seed root length, chlorophyll content, relative water content, relative conductivity, malondialdehyde (MDA), ascorbic acid (ASA), anti oxidase activity (SOD, POD, CAT, APX), endogenous ABA, detection of proline and other physiological and biochemical indexes, under drought and salt stress, the expression of AhLOS5 in transgenic tobacco transgenic plants with endogenous ABA content significantly increased, antioxidant enzyme activity increased, membrane lipid integrity, osmotic adjustment substance content is high. Overexpression of AhLOS5 can significantly improve the transgenic lines resistant to drought and salt stress. (7) in the other 3 of the transgenic tobacco resistance related gene DREB2B, RD22 Northern blot method was used to detect the expression of P5CS. The results showed, Under drought and salt stress, 3 genes, DREB2B, transgenic and wild type controls were RD22, P5CS induced expression; antisense transgenic plants not only depend on the ABA resistance gene expression induced by DREB2B, ABA dependent resistance genes RD22 and P5CS are not induced. This proves that AhLOS5 participate in the plant resistance belongs to the ABA dependent pathway, overexpression of AhLOS5 in transgenic tobacco resistance is produced by the regulation of endogenous ABA induced by stress.

【學(xué)位授予單位】：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：Q943.2;S565.2

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