本文關(guān)鍵詞：SlCycB2調(diào)控植物多細胞表皮毛形成和花器發(fā)育的機制研究　出處：《華中農(nóng)業(yè)大學》2017年博士論文　論文類型：學位論文

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【摘要】：植物表皮毛對抵御生物和非生物逆境具有重要作用,同時也是一種研究植物細胞命運調(diào)控的模式系統(tǒng)。擬南芥單細胞表皮毛形成受到MYB/bHLH/WD蛋白復合體的調(diào)控,該復合體通過激活下游表皮毛起始關(guān)鍵基因的表達,導致表皮細胞膨大而異化成表皮毛。番茄、煙草等多細胞表皮毛的調(diào)控機制不同于單細胞表皮毛。到目前為止,番茄、煙草等多細胞表皮毛的形成機制尚未被揭示。表皮毛的形成離不開細胞周期的調(diào)控,細胞周期蛋白在不同細胞周期的轉(zhuǎn)變過程中起到重要作用�；ㄆ鞴侔l(fā)育的研究具有重要的生物學意義,目前確定ABCDE模型可以用來揭示花器官形成調(diào)控機理。但是,本研究中的新型B型細胞周期蛋白是否參與花器官形成的調(diào)控還未可知。本研究主要對SlCycB2基因在番茄、煙草和擬南芥中的同源基因進行了鑒定,并在番茄和煙草中進行了功能分析。主要的結(jié)果如下:1.利用SlCycB2基因編碼的氨基酸序列在SGN、TAIR和NCBI等數(shù)據(jù)庫中篩選同源基因。在番茄中確定2個同源基因,命名為SlCycB3和SlCycB4;在煙草中確定3個同源基因,分別命名為NtCycB2、NtCycB3和NtCycB4;在擬南芥中確定2個同源基因,命名為AtCycB2和AtCycB3。一級結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)這類基因均只有一個外顯子,編碼100多個氨基酸,具有三個保守區(qū)。將該類基因與番茄、煙草和擬南芥中的功能已知的B型細胞周期蛋白進行系統(tǒng)進化樹分析,結(jié)果顯示它們是一類新型的B型細胞周期蛋白。2.利用番茄、煙草和擬南芥中SlCycB2的同源基因所編碼氨基酸序列在NCBI中進行Protein Blast分析,確定不同物種均含有SlCycB2的同源基因,且功能未知。該結(jié)果表明SlCycB2基因以及在不同物種的同源基因可能具有重要的生物學功能。3.SlCycB2和SlCycB3的組織表達譜分析結(jié)果顯示這兩個基因在番茄各個組織中都有表達,在花和葉中的表達最高。亞細胞定位分析確定SlCycB2所編碼蛋白定位于細胞核中。SlCycB2基因啟動子序列分析發(fā)現(xiàn)其中有多個光響應(yīng)元件。對栽培番茄Ailsa Craig進行光照和暗處理,測定SlCycB2和SlCycB3基因的表達量,結(jié)果顯示二者均受到光的誘導,受到暗條件的抑制。構(gòu)建SlCycB2基因啟動子驅(qū)動GUS-YFP融合表達載體,轉(zhuǎn)化番茄并分析該基因的表達特點,實驗結(jié)果表明該基因在下胚軸、莖表皮毛、葉表皮毛、花中的柱頭和未成熟的果實中都有表達,且在表皮毛的腺體中高表達。4.轉(zhuǎn)基因功能分析確定SlCycB2基因參與調(diào)控番茄表皮毛的形成。SlCycB2超量表達載體和RNAi抑制表達載體分別導入到栽培番茄AC獲得轉(zhuǎn)基因植株。qRT-PCR分析結(jié)果顯示SlCycB2基因的表達水平在超量表達轉(zhuǎn)基因植株中顯著上調(diào),而在抑制表達轉(zhuǎn)基因植株中顯著下調(diào)。SlCycB2超量表達植株中表皮毛密度顯著減少,非腺體毛和I型腺體毛幾乎消失,VI和VII型腺體毛的密度顯著降低。而在SlCycB2-RNAi抑制表達植株上表皮毛密度顯著增加,且主要是III型和V型非腺體毛顯著增加,而且莖上形成了III type-like超長毛,其他類型的表皮毛沒有明顯變化。5.SlCycB2超量表達植株葉片萜類含量的測定結(jié)果顯示與對照AC相比,SlCycB2超量表達植株葉片中萜類化合物(包括單萜和倍半萜)的含量極顯著降低。萜類化合物對生物具有重要的防御作用。因此,分析了轉(zhuǎn)基因材料對斜紋夜蛾的抗性實驗,結(jié)果表明SlCycB2超量表達植株更易遭受斜紋夜蛾的啃食。綜合這些結(jié)果,推測SlCycB2基因可能通過調(diào)控VI型表皮毛的形成,影響萜類物質(zhì)的生物合成,進而影響其生物防御的效果。6.轉(zhuǎn)基因功能分析還表明SlCycB2基因調(diào)控番茄花器官的發(fā)育。SlCycB2超量表達植株表現(xiàn)出花藥開裂,花柱變短的表型,坐果率顯著降低。SEM觀察發(fā)現(xiàn)畸形花粉顯著增加,花柱細胞變短和柱頭乳突細胞畸形。實驗結(jié)果表明SlCycB2參與調(diào)控番茄花柱和花粉的發(fā)育。7.RNA-seq分析結(jié)果表明,SlCycB2超量表達植株和對照AC植株之間具有241個差異表達基因(DEGs);SlCycB2-RNAi抑制表達植株和對照AC之間有84個差異表達的基因;SlCycB2超量表達植株和SlCycB2 RNAi植株之間有834個差異表達基因。對DEGs進行功能聚類分析,發(fā)現(xiàn)這些DEGs主要參與萜類代謝、角質(zhì)蠟質(zhì)合成和蛋白酶抑制因子的合成等途徑。這暗示了SlCycB2超量表達植物中次生代謝物(如萜類化合物)的減少導致其對食草性昆蟲的防御力減弱。8.轉(zhuǎn)基因分析結(jié)果顯示SlCycB2在不同物種的同源基因具有相同的多細胞表皮毛調(diào)控功能。利用pMV2載體構(gòu)建了SlCycB3、SlCycB4、Nt CycB2、NtCycB3、NtCycB4、AtCycB2和AtCycB3基因的超量表達載體,利用pHELLSGATE2構(gòu)建了SlCycB3和SlCycB4的RNAi抑制表達載體,遺傳轉(zhuǎn)化獲得轉(zhuǎn)基因植株。利用qRT-PCR和RT-PCR檢測目的基因的表達水平,確定這幾個基因在超量表達植株中均上調(diào)表達;SlCycB3和SlCycB4在RNAi抑制表達植株中均下調(diào)表達。表型分析發(fā)現(xiàn)SlCycB3、AtCycB2和NtCycB2超量表達轉(zhuǎn)基因植株的表皮毛密度顯著減少;SlCycB3-RNAi抑制表達植株的表皮毛密度顯著增加,說明這類基因具有相同的多細胞表皮毛調(diào)控功能。9.SlCycB2、SlCycB3、NtCycB2和AtCycB2超量表達番茄植株中SlCycB2和SlCycB3的表達量進行測定,結(jié)果顯示在Nt CycB2和AtCycB2超量表達轉(zhuǎn)基因番茄植株中SlCycB2和SlCycB3基因都下調(diào)表達;在SlCycB3超量表達番茄植株中SlCycB2基因亦下調(diào)表達;同樣,在SlCycB2超量表達植株中SlCycB3也下調(diào)表達。推測這類基因可能受其同源基因的表達水平的影響。10.構(gòu)建的SlCycB3、SlCycB4、NtCycB2、NtCycB3、NtCycB4、AtCycB2和AtCycB3超量表達載體遺傳轉(zhuǎn)化煙草獲得轉(zhuǎn)基因植株。表型分析確定SlCycB2、SlCycB3、AtCycB2和Nt CycB2轉(zhuǎn)基因植株的表皮毛密度顯著降低,而SlCycB4、AtCycB2、NtCycB3和NtCycB4轉(zhuǎn)基因植株的表型沒有變化。SEM觀察發(fā)現(xiàn)SlCycB2和AtCycB2轉(zhuǎn)基因植株中長柄和短柄腺體毛密度都顯著減少。因此推測茄科作物可能具有相似的多細胞表皮毛調(diào)控途經(jīng)。
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【學位授予單位】：華中農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：Q943.2

【參考文獻】

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1 楊長憲;番茄Wo基因調(diào)控表皮毛形成和胚胎發(fā)育的機理解析[D];華中農(nóng)業(yè)大學;2011年

2 歐陽波;幾種病程相關(guān)蛋白基因轉(zhuǎn)化番茄的研究[D];華中農(nóng)業(yè)大學;2003年

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1 苗青;番茄Sly-miR167啟動子的分離與調(diào)控分析[D];重慶大學;2011年

2 侯政;利用酵母雙雜交系統(tǒng)篩選與番茄RIN互作蛋白的初步研究[D];華中農(nóng)業(yè)大學;2009年

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本文編號：1431135