本文關(guān)鍵詞：H7N9亞型流感病毒遺傳演化分析及H7N9弱毒疫苗在哺乳動物模型上的免疫效力評價　出處：《中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院》2016年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：H7N9亞型流感病毒目前在我國呈散發(fā)流行態(tài)勢,且在不斷的進化重組,不僅給我國的養(yǎng)禽業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟損失,也給人類健康造成了巨大的威脅。截止到2016年2月28日,已造成747人感染,297人死亡。本研究對2013年來本實驗室分離到的210株H7N9病毒株進行了系統(tǒng)的遺傳演化分析和關(guān)鍵分子特征分析。根據(jù)時間劃分,可將2013年至2016年2月間的H7N9疫情分為四個時期。比較各個基因同源性發(fā)現(xiàn),HA和NA基因的核苷酸同源性分別處在96.9-100%和97.3-100%之間;另外6個內(nèi)部基因片段PB2、PB1、PA、NP、M和NS的核苷酸同源性分別為95.1-100%、95.3-100%、94.7-100%、93.6-100%、95.2-100%和93.7-100%。根據(jù)各基因進化樹劃分結(jié)果,可以將66株全基因組測序的2013分支病毒分為12個基因型。第一波疫情疫情背景較為簡單,只有3個基因型;第二波和第三波疫情,背景較為復(fù)雜,基因型分別為8個和7個;但主要基因型不變,仍為基因1型。以上結(jié)果表明,H7N9病毒表面基因在進化上相對穩(wěn)定,內(nèi)部基因的進化率要高于表面基因,這可能是因為H7N9在我國蔓延的過程中不斷的與H9N2亞型禽流感病毒發(fā)生重組所致。進一步分析發(fā)現(xiàn),所有本實驗室2013分支H7N9病毒分離株M2蛋白都有S31N突變,表明對金剛烷胺類藥物耐藥,所有H7N9病毒仍對神經(jīng)氨酸酶抑制劑敏感;所有分離到的H7N9病毒裂解位點均只有一個堿性氨基酸,所有PB2蛋白627位為E,均為低致病性特征。耐藥毒株的出現(xiàn)以及人傳人的可能性,促使人們研發(fā)一種有效的疫苗來應(yīng)對H7N9病毒。本研究利用反向遺傳操作技術(shù),將人分離株A/Anhui/1/2013(H7N9)(AH/1)的表面基因HA和NA與冷適應(yīng)流感病毒株A/AnnArbor/6/60(H2N2)(AAca)的6個內(nèi)部基因片段重組,構(gòu)建出一株重組弱毒疫苗株H7N9/AAca。利用多種動物模型評價了該疫苗的安全性、免疫原性和保護效力。在小鼠和雪貂模型上,該疫苗株的毒力顯著致弱,小鼠和雪貂感染后,均不表現(xiàn)出臨床癥狀,且病毒的復(fù)制局限于上呼吸道并呈低水平復(fù)制。在小鼠、豚鼠和雪貂上,H7N9/AAca一免之后能誘導(dǎo)產(chǎn)生一定程度的血凝抑制和中和抗體水平,二免之后誘導(dǎo)產(chǎn)生的血凝抑制和中和抗體水平顯著升高并達到了理想的水平。在小鼠、豚鼠和雪貂上,H7N9/AAca一免之后并不能完全阻止病毒復(fù)制,但是能夠顯著降低病毒復(fù)制的水平,而且動物不表現(xiàn)出臨床癥狀;二免之后,該疫苗能完全阻止病毒在動物體內(nèi)的復(fù)制。另外,H7N9/AAca一免之后能夠完全阻止病毒經(jīng)飛沫和直接接觸感染豚鼠。綜上所述,我國流行的H7N9亞型流感病毒目前相對穩(wěn)定,主要流行基因型為G1型。H7N9/AAca具有良好的安全性和免疫原性,并且具有良好的免疫保護效力。H7N9/AAca弱毒疫苗可以作為儲備疫苗以應(yīng)對目前的H7N9疫情。動物實驗結(jié)果表明,該疫苗具有在人上進行下一步臨床試驗的價值。
[Abstract]:The H7N9 subtype influenza virus is spreading and recombination in China, which not only brings great economic losses to poultry industry in China. It also poses a huge threat to human health. As of February 28th 2016, 747 people had been infected. In this study, 210 strains of H7N9 virus isolated in our laboratory since 2013 were systematically analyzed for genetic evolution and key molecular characteristics. The H7N9 outbreak from 2013 to February 2016 can be divided into four stages. The nucleotide homology of HA gene and na gene was 96.9-100% and 97.3-100%, respectively. The nucleotide homology of the other six internal gene fragments PB2, PB1, PANPM and NS were 95.1-100, 95.3-100 and 94.7-100%, respectively. 93.6-100%, 95.2-100% and 93.7-1000.The results were divided according to the phylogenetic tree of each gene. There were 12 genotypes of the 66 strains of the virus which were sequenced in the whole genome. The background of the first wave of the virus was relatively simple, with only 3 genotypes. In the second and third waves, the background was complicated, and the genotypes were 8 and 7, respectively. The results showed that the surface gene of H7N9 virus was relatively stable in evolution, and the evolution rate of internal gene was higher than that of surface gene. This may be due to the continuous recombination of H7N9 with H9N2 subtype avian influenza virus during the spread of H7N9 in China. All strains of H7N9 virus in our laboratory had S31N mutation, indicating that they were resistant to amantadine, and all H7N9 viruses were still sensitive to neuraminidase inhibitors. All the isolated H7N9 virus cleavage sites had only one basic amino acid, and all PB2 proteins at position 627 were characterized by low pathogenicity, the emergence of drug-resistant strains and the possibility of human-to-human transmission. In order to develop an effective vaccine against H7N9 virus, this study uses reverse genetic manipulation technology. The surface genes HA and na of the human isolate A / Anhui / 1 / 2013 H7N9 / AH / 1 were compared with the cold adapted influenza strain A / R Ann Arborr / 6 / 60. Six internal gene fragments of H2N2AAAca) were recombined. A recombinant attenuated vaccine strain H7N9 / AAca. was constructed to evaluate the safety, immunogenicity and protective efficacy of the vaccine in mice and ferrets using various animal models. The virulence of the vaccine strain was significantly weakened, neither mice nor ferrets showed any clinical symptoms after infection, and the replication of the virus was limited to the upper respiratory tract and was replicated at a low level in mice, guinea pigs and ferrets. After H7N9 / AAca immunization, a certain degree of hemagglutination inhibition and neutralizing antibody level were induced. The level of hemagglutination inhibition and neutralizing antibody induced after the second immunization was significantly increased and reached the desired level. In mice, guinea pigs and ferrets, H7N9 / AAca immunization did not completely prevent the replication of the virus after the administration of H7N9 / AAca in mice, guinea pigs and ferrets. But it can significantly reduce the level of viral replication, and animals do not show clinical symptoms; After the second immunization, the vaccine could completely stop the replication of the virus in animals. In addition, H7N9 / AAca could completely prevent the virus from infecting guinea pigs through droplets and direct contact. The H7N9 subtype influenza virus in China is relatively stable at present. The main genotype is G1. H7N9 / AAca has good safety and immunogenicity. And has a good immune protection. H7N9 / AAca attenuated vaccine can be used as a reserve vaccine to respond to the current H7N9 epidemic. The vaccine has the value of further clinical trials in humans.
【學(xué)位授予單位】：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S852.65

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本文編號：1426534