本文關鍵詞：水稻蠟質合成代謝基因WSL3及WSL4的克隆和功能分析　出處：《中國農業(yè)科學院》2016年博士論文　論文類型：學位論文

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【摘要】：陸地植物表面覆蓋著一層蠟質層,蠟質作為植物表面與環(huán)境之間的第一層屏障,具有重要的功能。蠟質能防止植物水分的流失,能屏蔽過量的紫外線,能形成自潔式的表面抵御外來的灰塵,能作為物理屏障來抵擋害蟲和病原菌的侵害,還能在器官邊界確定上起到重要的作用。水稻作為重要的模式作物,對水稻蠟質控制基因進行研究,進而利用其改良水稻的抗逆能力,具有重要的意義。本文以兩個水稻葉片蠟質減少突變體Wax crystal-sparse leaf 3(wsl3)和Wax crystal-sparse leaf 4(wsl4)為材料,在表型鑒定的基礎上,利用圖位克隆技術對目標基因進行了分離,進一步對其功能進行了初步的研究,主要內容如下:1.蠟質突變體wsl3和wsl4的表型分析通過對日本晴組培突變體庫的篩選,獲得了水稻葉片蠟質減少的突變體wsl3和wsl4。兩個突變體均呈現(xiàn)葉片沾水的表型,且wsl4突變體比野生型株高略矮,分蘗數(shù)減少。透射電鏡(TEM)觀察發(fā)現(xiàn)wsl3和wsl4突變體葉片表皮增厚。掃描電鏡(SEM)觀察發(fā)現(xiàn)突變體葉片表面蠟質晶體顯著性降低。GC-MS測定發(fā)現(xiàn)盡管突變體葉片表面角質含量與野生型相當,但是,突變體葉片表面蠟質各成分含量相對于野生型則顯著性下降。生理學實驗表明,wsl3和wsl4突變體的細胞膜通透性都有一定程度的升高。2.蠟質代謝合成基因WSL3和WSL4的圖位克隆和功能驗證利用圖位克隆技術,我們將WSL3定位于4號染色體InDel標記M-2396和M-2404之間83kb區(qū)間內,對該區(qū)間的基因測序發(fā)現(xiàn)LOC_Os04g40730第一個外顯子的736和737的兩個連續(xù)的堿基GC突變?yōu)門T,導致了所編碼的蛋白質第207位的氨基酸由丙氨酸突變?yōu)楸奖彼�。WSL4基因定位于3號染色體InDel標記M-6283和M-6341的58 kb區(qū)間內,對該區(qū)間基因測序發(fā)現(xiàn)Loc_Os03g12030基因的1281位的堿基由G突變?yōu)锳,位于第二個外顯子上,導致了所編碼的蛋白質第312位的氨基酸由纈氨酸突變?yōu)榧琢虬彼�。生物信息學分析結果表明LOC_Os04g40730和Loc_Os03g12030分別編碼KCR和KCS類蛋白,都是蠟質合成途徑的基因。進一步的遺傳互補和RNAi干擾實驗表明這兩個基因即為目標基因。3.WSL3和WSL4基因的時空表達分析及亞細胞定位利用實時熒光定量RT-PCR和GUS表達實驗對WSL3和WSL4兩個基因的表達模式進行了分析。結果表明,WSL3和WSL4在根、莖、葉、花等各個組織中均有表達,屬于組成型表達基因。構建WSL3和WSL4基因的亞細胞定位GFP載體,在煙草中瞬時表達,發(fā)現(xiàn)它們都能與ER marker共定位,表明WSL3和WSL4蛋白都定位于內質網上。4.WSL3蛋白具有脂肪酸延長酶活性在酵母ybr159wΔ突變體中異源表達水稻的WSL3基因,其生長缺陷的表型能得到恢復。當WSL3基因與擬南芥的FAE1基因在ybr159wΔ突變體中共表達的時候,能在酵母ybr159wΔ突變體檢測到20:0,22:0,20:1Δ11以及22:1Δ13四種脂肪酸產物,這些結果表明WSL3具有KCR酶的脂肪酸延長酶活性。
[Abstract]:The surface of terrestrial plants is covered with a waxy layer which acts as the first barrier between the plant surface and the environment and has important functions. Wax can prevent the loss of plant water and shield from excessive ultraviolet rays. It can form a self-cleaning surface to resist foreign dust, can act as a physical barrier against pests and pathogens, but also plays an important role in the determination of organ boundaries. Rice is an important model crop. In order to improve the stress resistance of rice, the waxy controlling gene of rice was studied. In this paper, two rice leaf waxy reduction mutants, Wax crystal-sparse leaf 3 and wsl3, were used. And Wax crystal-sparse leaf 4wsl4). On the basis of phenotypic identification, the target gene was isolated by map cloning, and its function was studied preliminarily. The main contents are as follows: 1. Phenotypic analysis of waxy mutants wsl3 and wsl4 through screening of Japanese clear tissue culture mutants library. The two mutants, wsl3 and wsl4. both showed the phenotype of water soaking in leaves, and the wsl4 mutants were slightly shorter than wild type plants. The number of tillers decreased and the leaf epidermis of wsl3 and wsl4 mutants were observed by TEM. It was observed that the waxy crystals on the leaf surface of the mutant decreased significantly. GC-MS showed that the keratinine content on the leaf surface of the mutant was similar to that of the wild type. However, the contents of waxy components on the leaf surface of the mutant decreased significantly compared with the wild type. The membrane permeability of both wsl3 and wsl4 mutants increased to a certain extent. 2. Map cloning and functional verification of waxy metabolic synthesis genes WSL3 and WSL4 using map cloning technology. We mapped WSL3 in the 83kb region between M-2396 and M-2404 on chromosome 4 InDel marker. Sequencing of the gene in this region revealed that two consecutive base GC mutations of 736 and 737 of the first exon of LOC_Os04g40730 were TT. The amino acid at position 207 of the encoded protein was mutated from alanine to phenylalanine. WSL4 gene was mapped to 58 labeled M-6283 and M-6341 on chromosome 3 by InDel. Within the kb interval. Sequencing of the interval gene revealed that the 1281 base of the Loc_Os03g12030 gene mutated from G to A, and was located on the second exon. The amino acid at position 312 of the encoded protein mutated from valine to methionine. Bioinformatics analysis showed that LOC_Os04g40730 and Loc_Os03g1203. 0 encodes KCR and KCS class proteins respectively. Further genetic complementation and RNAi interference experiments show that these two genes are the target genes. 3. Spatio-temporal expression analysis and subcellular localization of WSL3 and WSL4 genes. The expression patterns of WSL3 and WSL4 genes were analyzed by real-time fluorescence quantitative RT-PCR and GUS expression experiments. WSL3 and WSL4 are expressed in root, stem, leaf, flower and other tissues, which belong to the constitutive expression gene. Subcellular localization GFP vector of WSL3 and WSL4 gene was constructed. Transient expression in tobacco showed that they could co-locate with ER marker. The results showed that both WSL3 and WSL4 proteins were located in the endoplasmic reticulum. 4. WSL3 protein had fatty acid prolongation enzyme activity and heterologous expression of WSL3 gene in yeast ybr159w 螖 mutant. The phenotype of growth defect could be recovered when WSL3 gene and Arabidopsis FAE1 gene were co-expressed in ybr159w 螖 mutant. Four fatty acid products, 20: 20: 22: 20: 1 螖 11 and 22: 1 螖 13, could be detected in yeast ybr159w 螖 mutants. These results indicated that WSL3 had the activity of fatty acid prolongation enzyme of KCR enzyme.
【學位授予單位】：中國農業(yè)科學院
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：Q943.2

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本文編號：1424005