本文關(guān)鍵詞：乳桿菌表層蛋白的理化性質(zhì)和生物學(xué)功能研究　出處：《江南大學(xué)》2016年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

  更多相關(guān)文章： 乳桿菌 表層蛋白 表面性質(zhì) 黏附特性 細(xì)胞凋亡

【摘要】：乳桿菌是人及動物腸道內(nèi)的生理性細(xì)菌,因其對宿主有良好的益生作用而被廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥行業(yè)。乳桿菌外層包裹著一種表層蛋白,可通過非共價作用連接于古生菌和細(xì)菌的細(xì)胞壁。近年來陸續(xù)有研究發(fā)現(xiàn)表層蛋白對乳桿菌發(fā)揮益生功能有著卓著的貢獻(xiàn)。但并非所有乳桿菌都具有表層蛋白結(jié)構(gòu),且研究多集中于少數(shù)菌種。因此,對于豐富的乳桿菌資源,可用于研究比對的表層蛋白數(shù)據(jù)資源非常有限。本文從大量的乳桿菌資源中甄別具有表層蛋白的乳桿菌,提取表層蛋白并解析其理化性質(zhì);通過研究表層蛋白對乳桿菌表面性質(zhì)、消化道耐受力、黏附性質(zhì)和抑菌能力的影響,明確表層蛋白對乳桿菌的生物學(xué)貢獻(xiàn);最后,為深入了解乳桿菌表層蛋白的生物學(xué)功能,對不同乳桿菌表層蛋白的抑菌機(jī)制進(jìn)行了進(jìn)一步研究,為乳桿菌及其表層蛋白在食品、醫(yī)藥行業(yè)的應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。以已知具有表層蛋白的Lactobacillus acidophilus NCFM作為參照菌株。對30株待篩選的乳桿菌進(jìn)行LiCl處理,對其提取物進(jìn)行SDS-PAGE分析,發(fā)現(xiàn)僅6株乳桿菌的提取物有明顯的表層蛋白條帶,分別是L.bulgaricus fb04、L.casei fb05、L.rhamnosus fb06、L.gasseri fb07、L.gasseri fb08、L.acidophilus fb11。6種乳桿菌表層蛋白的相對分子質(zhì)量均在45,000-47,000。采用透射電鏡對比觀察LiCl處理前后乳桿菌表層結(jié)構(gòu)的變化,進(jìn)一步確認(rèn)了上述乳桿菌的表層結(jié)構(gòu)。利用離子交換色譜對7種表層蛋白進(jìn)行純化,得到純度較高的表層蛋白用于理化性質(zhì)分析。氨基酸組成分析表明7種表層蛋白氨基酸組成相似,均含有大量的疏水性氨基酸(31%-49%),堿性氨基酸含量高于酸性氨基酸,符合文獻(xiàn)報道的表層蛋白的一般特性。采用圓二色譜法對表層蛋白的二級結(jié)構(gòu)進(jìn)行解析,發(fā)現(xiàn)兩株加氏乳桿菌、兩株嗜酸乳桿菌表層蛋白二級結(jié)構(gòu)的組成比例相似。但其余幾株乳桿菌表層蛋白二級結(jié)構(gòu)組成則差異較大。因此,推測加氏乳桿菌和嗜酸乳桿菌表層蛋白的二級結(jié)構(gòu)與菌株親緣性相關(guān)。采用差示掃描量熱法測定表層蛋白的熱變性溫度,結(jié)果表明7種表層蛋白均只有一個熱變性溫度。熱變性溫度最低的是L.bulgaricus fb04,43.14±0.82°C;最高的是L.rhamnosus fb06,72.83±0.60°C;其余5種表層蛋白的熱變性溫度在59-71°C之間。綜合分析二級結(jié)構(gòu)與熱變性溫度的結(jié)果,發(fā)現(xiàn)β-折疊比例較高的表層蛋白,其熱變性溫度相應(yīng)較高。從表面疏水性、表面電荷、聚集能力和消化道耐受力多個方面研究了表層蛋白對乳桿菌菌體的生物學(xué)貢獻(xiàn)。剝除表層蛋白之后,7株乳桿菌的表面疏水性、表面電荷、聚集能力和消化道耐受力均顯著下降(P0.05)。在膽鹽應(yīng)激條件下,6株乳桿菌表層蛋白的表達(dá)量提高了1.5-2.8倍。這些結(jié)果提示表層蛋白對乳桿菌的表面性質(zhì)有著積極的貢獻(xiàn),且有助于乳桿菌抵抗不良的生存環(huán)境。以I型、V型膠原蛋白和HT-29細(xì)胞作為腸道組織模型,研究了表層蛋白對乳桿菌黏附性質(zhì)和抑菌能力的影響。失去表層蛋白后,7株乳桿菌黏附膠原蛋白和HT-29細(xì)胞的能力分別下降了37%-95%和63%-94%。乳桿菌抑制Escherichia coli和Salmonella typhimurium侵襲HT-29細(xì)胞的能力也被顯著削弱。利用純化后的表層蛋白對E.coli和S.typhimurium的黏附作用進(jìn)行干預(yù),發(fā)現(xiàn)7種表層蛋白均可顯著減少E.coli和S.typhimurium對I型和V型膠原蛋白的黏附;還可通過排斥、競爭和替換的方式抑制E.coli和S.typhimurium對HT-29細(xì)胞的黏附,其中排斥作用效果最強(qiáng)。以上結(jié)果表明,表層蛋白不僅有助于乳桿菌黏附于腸道、抑制腸道致病菌侵襲,還可作為抗黏附劑,減少E.coli和S.Typhimurium對腸道組織的黏附。為了進(jìn)一步揭示乳桿菌表層蛋白抑制致病菌感染的機(jī)制,研究了7種乳桿菌表層蛋白對E.coli和S.typhimurium細(xì)胞壁肽聚糖的水解酶活性。通過測定致病菌的生長曲線和菌落計數(shù),發(fā)現(xiàn)7種表層蛋白中只有L.acidophilus NCFM和L.acidophilus fb11的表層蛋白可以直接抑制E.coli和S.typhimurium的生長。酶譜分析結(jié)果顯示兩種L.acidophilus表層蛋白可水解E.coli和S.typhimurium的細(xì)胞壁肽聚糖,推測嗜酸乳桿菌表層蛋白可能是一種肽聚糖水解酶。利用透射電鏡和流式細(xì)胞術(shù)分析表層蛋白水解細(xì)胞壁肽聚糖對致病菌外表形態(tài)和生理狀態(tài)的影響,發(fā)現(xiàn)表層蛋白的胞壁質(zhì)水解酶活性可使E.coli和S.typhimurium處于細(xì)胞壁破損但胞內(nèi)酶活仍較旺盛的亞致死狀態(tài)。在7種表層蛋白中,這是嗜酸乳桿菌表層蛋白特有的一種抑制致病菌的機(jī)制。從細(xì)胞凋亡的角度研究了乳桿菌表層蛋白抑制致病菌感染的機(jī)制。首先通過Hoechst 33342/PI雙染,在熒光顯微鏡下觀察到L.casei fb05、L.rhamnosus fb06、L.acidophilus fb11和L.acidophilus NCFM的表層蛋白可減少E.coli和S.typhimurium導(dǎo)致的HT-29細(xì)胞染色質(zhì)凝聚。采用流式細(xì)胞術(shù)分析Annexin V-FITC/PI雙染細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)以上4種表層蛋白可減少E.coli和S.typhimurium導(dǎo)致的HT-29細(xì)胞的早期凋亡。對細(xì)胞凋亡通路中的關(guān)鍵因子進(jìn)行測定,結(jié)果顯示4種表層蛋白可通過穩(wěn)定胞內(nèi)線粒體膜電位和Ca2+濃度水平,抑制Caspase-1、Caspase-9和Caspase-3的激活,從而降低E.coli和S.typhimurium引起的細(xì)胞凋亡。說明這4種乳桿菌表層蛋白可通過調(diào)控線粒體介導(dǎo)的凋亡通路減少腸道致病菌引起的上皮細(xì)胞的凋亡與損傷。綜上所述,共篩選出7株攜帶表層蛋白的乳桿菌,并分析了表層蛋白的理化性質(zhì)。證實了表層蛋白對乳桿菌表面性質(zhì)、消化道耐受力、黏附性質(zhì)和抑菌能力的積極貢獻(xiàn)。在細(xì)胞和分子水平上,探索了不同表層蛋白的抑菌機(jī)制,為乳桿菌及其表層蛋白在健康干預(yù)領(lǐng)域的實際應(yīng)用提供了理論支持。
[Abstract]:Lactobacillus plantarum NCFM was used as reference strain . In this paper , the mechanism of inhibiting pathogenic bacteria in E . coli and S . typhimurium was studied by means of flow cytometry . The results showed that four kinds of surface proteins could reduce the apoptosis and injury of HT - 29 cells induced by E . coli and S . typhimurium .

【學(xué)位授予單位】：江南大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：TS201.3

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前4條

1 王敏;小琴;那日蘇;王彩鳳;特尼格爾;趙慧;格日勒圖;;嗜酸性乳桿菌MG株S層蛋白的高級結(jié)構(gòu)預(yù)測分析及原核表達(dá)[J];動物醫(yī)學(xué)進(jìn)展;2013年04期

2 肖榮;范郁冰;王遠(yuǎn)亮;李宗軍;;富含S-層蛋白乳酸菌的鑒定及其消化酶耐受性研究[J];食品科學(xué);2011年19期

3 王麗群;張佰榮;王彥;尚玉琳;孟祥晨;;雙歧桿菌體外對Caco-2的黏附及其表面性質(zhì)分析[J];微生物學(xué)報;2010年05期

4 肖榮;楊秀華;王遠(yuǎn)亮;李宗軍;;乳酸桿菌的篩選及其S-層蛋白的初步研究[J];農(nóng)產(chǎn)品加工(學(xué)刊);2008年11期

，

本文編號：1419638