發(fā)布時(shí)間：2018-01-09 04:08

  本文關(guān)鍵詞：藏羚羊與普氏原羚異種克隆胚胎發(fā)育的轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究　出處：《內(nèi)蒙古大學(xué)》2016年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：藏羚羊(Pantholops hodgsonii)和普氏原羚(Procapra przewalskii),屬偶蹄目牛科原羚屬,主要分布在我國青藏高原的青海、西藏和新疆,是世界上最瀕危物種。體細(xì)胞重編技術(shù)給保護(hù)瀕危物種,提供了另一種潛在的途徑。體細(xì)胞重編程技術(shù)主要包括：體細(xì)胞核移植(Somatic cell nuclear transfer, SCNT)技術(shù)和誘導(dǎo)多能干細(xì)胞技術(shù)(induced pluripotent stem cells)。但是,親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的物種異種克隆生產(chǎn)后代比較困難,這可能會(huì)歸因于一些發(fā)育相關(guān)的機(jī)制的原因。本研究當(dāng)中供體細(xì)胞是已經(jīng)處于分化末端的藏羚羊和普氏原羚體細(xì)胞,在以牛卵母細(xì)胞作為受體胞質(zhì),構(gòu)建藏羚羊-牛異種克隆重構(gòu)胚(ZBNT)和普氏原羚-牛異種克隆重構(gòu)胚(PBNT),研究發(fā)現(xiàn)在異種克隆胚胎中早期的發(fā)育的8-16細(xì)胞時(shí)期會(huì)產(chǎn)生發(fā)育阻滯,囊胚的發(fā)育率在1.5%之下。我們首先從胚胎發(fā)育的阻滯期做了轉(zhuǎn)錄組學(xué)的分析,試圖找出異種克隆胚胎發(fā)育阻滯的原因。同時(shí)采用了體細(xì)胞重編程技術(shù)手段-誘導(dǎo)干細(xì)胞多能性技術(shù),對(duì)藏羚羊體細(xì)胞在體外進(jìn)行了多能性誘導(dǎo),之后再應(yīng)用到異種克隆胚胎研究當(dāng)中,旨在從另外一種渠道來提高異種克隆胚胎發(fā)育效率。1、我們首先以普氏原羚的成體細(xì)胞作為核供體,以牛的卵母細(xì)胞作為受體胞質(zhì),進(jìn)行異種克隆操作,并且對(duì)牛同種和普氏原羚-牛異種克隆胚胎進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組基因芯片分析。分析結(jié)果顯示：牛-牛同種克隆胚胎基因表達(dá)與重編程相關(guān)的基因要顯著高于異種克隆胚胎(1527：643)。在異種克隆胚胎中,總共有139個(gè)與轉(zhuǎn)錄調(diào)控相關(guān)轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子(TFs)沒有被激活。在同種克隆胚胎中,母源性降解相關(guān)的基因有1515個(gè)基因表達(dá)下調(diào),而在普氏原羚-牛異種克隆胚胎當(dāng)中,只有343基因下調(diào)。線粒體與核DNA互作相關(guān)的基因,特別是TOMM (translocase of outer mitochondrial membrane)/TIMM (translocase of inner mitochondrial membrane)復(fù)合物基因,在同種克隆當(dāng)中有很高的表達(dá),而在異種克隆胚胎中表達(dá)量很低。綜上所述,在PBNT的異種克隆胚胎中,母源基因的不恰當(dāng)?shù)慕到?轉(zhuǎn)錄因子的不完全激活、線粒體相關(guān)功能的基因的不正常表達(dá)可能導(dǎo)致細(xì)胞在異種胞質(zhì)當(dāng)中的重編程失敗,導(dǎo)致異種克隆胚胎發(fā)育異常。2、在以上研究的基礎(chǔ)上,對(duì)藏羚羊的成體細(xì)胞作為核供體,以牛的卵母細(xì)胞作為受體胞質(zhì),進(jìn)行異種克隆操作,并且研究了藏羚羊異種克隆胚胎的發(fā)育,并且以普氏原羚-牛、牛-牛重構(gòu)胚作為對(duì)照,研究發(fā)現(xiàn),藏羚羊-牛胚胎囊胚發(fā)育率為0.8%,與普氏原羚異種克隆胚胎發(fā)育率相近(1.07%),顯著的低于牛同種克隆胚胎的發(fā)育(22.9%)。我們又重新設(shè)計(jì)并且重新引入了藏羚羊-牛的異種克隆胚胎(ZBNT),試圖在異種克隆胚胎(ZBNT、PBNT)與同種克隆胚胎(BBNT)找出,在異種克隆胚胎發(fā)育中的共性。進(jìn)而更進(jìn)一步的揭示異種克隆胚胎發(fā)育阻滯的原因。對(duì)牛同種和普氏原羚-牛異種克隆胚胎、藏羚羊-牛異種克隆胚胎進(jìn)行了更為全面系統(tǒng)的轉(zhuǎn)錄組基因芯片分析。結(jié)果顯示：在與同種克隆胚胎相比之后,有411個(gè)基因是在異種克隆胚胎當(dāng)中所特有的表達(dá)下調(diào)基因,這些基因的GO分析集中在了細(xì)胞的膜系統(tǒng)功能區(qū)域,包括：nuclear lumen, intracellular organelle lumen, membrane-enclosed lumen, organelle lumen等功能區(qū)域；還有核糖體發(fā)生區(qū)域,包括：ribonucleoprotein complex biogenesis, ribosome biogenesis等功能區(qū)域。之后我們分析了TOMM (translocase of outer mitochondrial membrane)/TIMM (translocase of inner mitochondrial membrane)復(fù)合物基因家族,發(fā)現(xiàn)在異種胚胎當(dāng)中(包括藏羚羊-牛異種克隆胚胎、普氏原羚-牛異種克隆胚胎)表達(dá)整體下調(diào),與之前所得出結(jié)論完全相符。之后我們也發(fā)現(xiàn)在異種克隆共同表達(dá)下調(diào)的基因當(dāng)中,轉(zhuǎn)錄輔激活因子mediator復(fù)合物家族成員中一部分基因是非常明顯的,其中mediator家族是轉(zhuǎn)錄起始的一個(gè)重要的結(jié)構(gòu)蛋白,MED家族在異種克隆胚胎中整體表達(dá)趨勢(shì)下調(diào)。此外,有關(guān)核糖體發(fā)生功能區(qū)域的基因家族,包括：ribosomal protein large subunit (RPL家族)和ribosomal protein small subunit (RPS家族),這兩個(gè)家族的基因是編碼核糖體大小亞基的基因家族,在異種克隆胚胎(ZBNT和PBNT)當(dāng)中,有關(guān)核糖體合成相關(guān)的大小亞基表達(dá)普遍低于同種克隆胚胎(BBNT)。同樣,與同種克隆胚胎相比之后,有729個(gè)基因在異種克隆胚胎中表達(dá)上調(diào),通過GO分析之后,這些基因的主要功能集中在了nucleotide binding, purine nucleotide binding, ribonucleotide binding, purine ribonucleotide binding等相關(guān)的通路。在這些通路中HSP (Heat Shock Protein)家族基因在異種克隆胚胎中表達(dá)明顯高于在同種克隆胚胎中的表達(dá)。綜上所述,在ZBNT和PBNT的異種克隆胚胎中,不光是線粒體結(jié)構(gòu)相關(guān)基因TOMM/TIMM(復(fù)合物基因家族表達(dá)出現(xiàn)了異常,而且在轉(zhuǎn)錄起始的作用原件MED基因家族以及胞質(zhì)核糖體大小亞基發(fā)生相關(guān)基因,也會(huì)表達(dá)異常。這些基因的表達(dá)異常,也可能是導(dǎo)致異種克隆胚胎發(fā)育異常的,導(dǎo)致重編程過程失敗的重要原因。另外在ZBNT和PBNT的異種克隆胚胎中,HSP (Heat Shock Protein)家族基因表達(dá)會(huì)有明顯的上調(diào),其中也包括了HSP70, HSP90的重要亞基,HSP基因家族在細(xì)胞當(dāng)中扮演重要角色,對(duì)于細(xì)胞當(dāng)中物質(zhì)運(yùn)輸以及蛋白降解等機(jī)制具有重要作用。那么在異種克隆胚胎發(fā)育過程中,可能是在異種克隆胚胎發(fā)育當(dāng)中,存在一定的應(yīng)激機(jī)制,來促使胚胎當(dāng)中的HSP的表達(dá)。綜上所述,關(guān)于異種克隆胚胎當(dāng)中的這些表達(dá)異常,都有可能會(huì)是異種克隆胚胎發(fā)育低下的重要原因。3、此外,我們采用了誘導(dǎo)干細(xì)胞多能性技術(shù),對(duì)藏羚羊體細(xì)胞在體外進(jìn)行了多能性誘導(dǎo),之后再應(yīng)用到異種克隆胚胎研究當(dāng)中,旨在從另外一種渠道來提高異種克隆胚胎發(fā)育效率。本研究利用小鼠(Mus musculus)來源的Oct-4(又稱POU Class 5 Homeobox 1,簡稱：POU5F1)、Sox-2 (Sex Determining Region Y-Box 2)、Klf-4 (Kruppel-Like Factor 4)和c-Myc (V-Myc Avian Myelocytomatosis Viral Oncogene Homolog)等4種重編程因子,對(duì)藏羚羊體細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)重編程,并將誘導(dǎo)后的細(xì)胞作為移植入牛去核的卵母細(xì)胞中,進(jìn)行異種克隆操作,觀察異種克隆胚的體外發(fā)育情況。結(jié)果表明,經(jīng)過4因子誘導(dǎo)之后的藏羚羊細(xì)胞并沒有形成ES (embryonic stem cell,簡稱ES細(xì)胞)樣細(xì)胞克隆,但誘導(dǎo)之后的細(xì)胞增殖能力和形態(tài)都發(fā)生了改變。細(xì)胞周期分析發(fā)現(xiàn),誘導(dǎo)后的藏羚羊細(xì)胞(簡稱iPS-ZLY細(xì)胞)進(jìn)入G2-M期的比率高于藏羚羊成纖維細(xì)胞(21.5% vs 16.7%)。iPS-ZLY細(xì)胞在培養(yǎng)的第4天進(jìn)入生長的平臺(tái)期,而ZLY細(xì)胞則在第6天進(jìn)入平臺(tái)期。核型分析發(fā)現(xiàn),iPS-ZLY的正常2n核型比例與ZLY細(xì)胞相似(68.3%vs 69.6%)。iPS-ZLY細(xì)胞表達(dá)OCT-4基因。當(dāng)把iPS-ZLY細(xì)胞移植入去核的牛卵母細(xì)胞后,iPS-ZLY異種克隆桑葚胚和囊胚形成率分別為8.5%和2.4%,而ZLY異種克隆胚胎桑葚胚和囊胚形成率則分別為3.8%和0.95%。以上研究表明,經(jīng)過4種因子誘導(dǎo)之后藏羚羊體細(xì)胞,其增殖能力發(fā)生顯著改變,細(xì)胞生長周期加快,表達(dá)多能基因Oct-4；誘導(dǎo)細(xì)胞的異種克隆胚胎發(fā)育率顯著高于普通細(xì)胞,誘導(dǎo)細(xì)胞對(duì)于異種克隆胚胎發(fā)育有促進(jìn)作用。本研究首次利用重編程因子誘導(dǎo)藏羚羊體細(xì)胞,進(jìn)而對(duì)誘導(dǎo)之后的細(xì)胞進(jìn)行了包括細(xì)胞周期、染色體核型以及多能性基因的檢測(cè),雖然沒有形成干細(xì)胞樣細(xì)胞克隆形態(tài),但是多能性基因Oct-4開始表達(dá),是一個(gè)處于分化的體細(xì)胞和多能性細(xì)胞的種間狀態(tài),這樣的種間狀態(tài)有助于異種克隆胚胎的發(fā)育。本研究從體外誘導(dǎo)重編程結(jié)合異種克隆重編程對(duì)藏羚羊分化的體細(xì)胞進(jìn)行試驗(yàn)研究,在研究重編程機(jī)理以及物種保護(hù)具有指導(dǎo)意義。綜上所述,體細(xì)胞重編程技術(shù)主要包括：體細(xì)胞核移植技術(shù)(Somatic cell nuclear transfer, SCNT)和誘導(dǎo)多能干細(xì)胞技術(shù)(induced pluripotent stem cells)。親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的物種通過異種克隆生產(chǎn)后代比較困難,這可能會(huì)歸因于一些發(fā)育相關(guān)機(jī)制的原因。體細(xì)胞重編技術(shù)為保護(hù)瀕危物種,提供了另一種潛在的途徑。本文對(duì)藏羚羊和普氏原羚進(jìn)行了異種核移植試驗(yàn),研究發(fā)現(xiàn)在異種克隆胚胎發(fā)育過程中會(huì)形成發(fā)育阻滯的現(xiàn)象,之后研究針對(duì)于異種克隆發(fā)育過程阻滯機(jī)理以及如何提高異種克隆胚胎發(fā)育效率的問題開展了大量研究。研究的主要結(jié)果如下藏羚羊-牛和普氏原羚-牛異種克隆胚胎在發(fā)育過程中,存在發(fā)育阻滯。這可能歸因于在異種克隆胚胎中,轉(zhuǎn)錄因子的不完全激活、轉(zhuǎn)錄輔激活因子mediator復(fù)合物家族、線粒體相關(guān)TOMM/ TIMM復(fù)合物基因家族、核糖體發(fā)生功能區(qū)域的基因家族,包括：RPL家族和RPS家族的不正常表達(dá)可能導(dǎo)致細(xì)胞在異種胞質(zhì)當(dāng)中的重編程失敗,進(jìn)而導(dǎo)致異種克隆胚胎發(fā)育異常。另外,異種克隆胚胎中,HSP家族基因表達(dá)會(huì)有明顯的上調(diào),其中也包括了HSP70,HSP90的重要基因,這可能和異種克隆胚胎當(dāng)中的一些應(yīng)激機(jī)制有關(guān)。經(jīng)過4因子誘導(dǎo)之后的藏羚羊細(xì)胞并沒有形成ES樣細(xì)胞克隆。但誘導(dǎo)之后的細(xì)胞增殖能力和形態(tài)都發(fā)生了改變。并且,誘導(dǎo)之后的iPS-ZLY細(xì)胞表達(dá)OCT-4基因。當(dāng)把iPS-ZLY細(xì)胞移植入去核的牛卵母細(xì)胞后,異種克隆效率有了明顯的改善。以上這些研究對(duì)保護(hù)瀕危物種,提供了另一種潛在的途徑。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：內(nèi)蒙古大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：Q78;Q813

【參考文獻(xiàn)】

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