本文關鍵詞：GLTSCR2負調控Ⅰ型干擾素及抗病毒應答的分子機制　出處：《中國農業(yè)大學》2017年博士論文　論文類型：學位論文

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【摘要】：膠質瘤抑制候選基因 2(Glioma tumour-suppressor candidate region gene 2,GLTSCR2)基因位于人類腫瘤抑制功能區(qū)域19號染色體上,編碼分子量為60kDa的細胞蛋白。在腫瘤學中有廣泛的研究,但在病毒學領域中的功能尚不清楚。本研究探索GLTSCR2調控Ⅰ型干擾素的產生及細胞抗病毒應答的分子機制,以揭示GLTSCR2在病毒復制中的作用。本研究首先采用基因沉默或過表達細胞中的GLTSCR2基因,通過熒光定量PCR、病毒效價測定以及免疫印跡試驗,發(fā)現(xiàn)GLTSCR2蛋白與病毒的復制直接相關。進一步的GLTSCR2截短體、突變體試驗表明GLTSCR2羧基末端330-432位氨基酸,特別是出核位點氨基酸對病毒的復制促進作用至關重要。病毒感染或poly(I:C)刺激可引起GLTSCR2的細胞定位發(fā)生改變:從細胞核移位到細胞質中,而出核位點缺失的GLTSCR2則不能遷移出核,無論是否有病毒感染。為了探索GLTSCR2在促進病毒復制的機理,我們采用雙熒光素酶報告系統(tǒng)試驗,發(fā)現(xiàn)GLTSCR2顯著抑制IFN-β和NF-κB的活化,進一步運用免疫共沉淀和熒光素酶試驗,結果表明GLTSCR2,特別是羧基末端GLTSCR2靶向RIG-Ⅰ,并非MAVS、TBK-1,因此負調控IFN-β的活化,而出核位點缺失的GLTSCR2則不能顯著促進IFN-β的活化。為了揭示GLTSCR2負調控IFN-β產生的分子機制,進行了 GLTSCR2對RIG-Ⅰ磷酸化或泛素化突變體試驗,結果表明GLTSCR2并非通過磷酸化RIG-Ⅰ負調控IFN-β的產生,而是通過特異性移除RIG-Ⅰ上K63偶聯(lián)的泛素化鏈抑制RIG-Ⅰ的活化,從而負調控RIG-Ⅰ信號通路。進一步采用泛素化試驗,結果表明GLTSCR2能通過USP15,并非USP3、USP21或TRIM25,進而去除RIG-Ⅰ上K63偶聯(lián)的泛素化鏈,從而負調控RIG-Ⅰ活化和IFN-β的產生。最后,我們將GLTSCR2的截短體片段串聯(lián)穿透肽,構建G4-TAT基因,進行原核表達,細胞試驗結果表明,重組蛋白G4-TAT可以穿透細胞膜進入細胞,抑制Ⅰ型干擾素信號通路,負調控細胞抗病毒應答,因而利于病毒復制。綜上所述,GLTSCR2可以促進病毒的復制,病毒的感染導致GLTSCR2從細胞核移位到細胞質中,并通過招募USP15去泛素化RIG-Ⅰ的K63位泛素化鏈負調RIG-Ⅰ的活化,從而負調控Ⅰ型干擾素的抗病毒應答。而GLTSCR2羧基末端原核表達蛋白亦能負調控Ⅰ型干擾素的產生從而促進病毒的復制。
[Abstract]:Glioma 2 candidate genes (Glioma tumour-suppressor candidate region gene 2, GLTSCR2) gene in human tumor suppressor function region on chromosome 19, encoding a molecular weight of 60kDa cell protein. There has been extensive research in oncology, but in the field of Virology in function is unclear. This study explores the molecular mechanism and cell antiviral response GLTSCR2 regulation of type I IFN, in order to reveal the role of GLTSCR2 in viral replication. In this study we used the gene silencing or overexpression of GLTSCR2 gene in the cells by fluorescence quantitative PCR, virus titer determination and Western blot test, found GLTSCR2 protein and the replication of the virus directly related. The truncated GLTSCR2 further. Experiments show that the GLTSCR2 mutant 330-432 carboxy terminal amino acids, especially nuclear sites of virus replication amino acids promote the key to The virus infection or poly (I:C) stimulation can induce the cellular localization of GLTSCR2 is changed from nuclear translocation to the cytoplasm and nuclear sites of deletion of GLTSCR2 is not a nuclear migration, regardless of whether there is a virus infection. In order to explore the mechanism of GLTSCR2 in promoting viral replication, we used dual luciferase reporter system test found the activation of GLTSCR2 significantly inhibited IFN- and NF- Beta Kappa B, further by immunoprecipitation and luciferase test, the results show that GLTSCR2, especially the carboxyl terminus of GLTSCR2 targeting RIG- I, TBK-1 is not MAVS, therefore, the negative regulation of IFN- beta activation, and nuclear gene deletion of GLTSCR2 does not significantly promote the activation of IFN- beta. In order to reveal the molecular mechanism of GLTSCR2 negative regulation of IFN- beta, the GLTSCR2 of RIG- I phosphorylation or ubiquitination of mutant test results show that the GLTSCR2 is not through the phosphorylation of RIG- of the negative regulation of IFN- beta Production, but through the ubiquitin chain specific RIG- 1 K63 remove coupling to inhibit activation of RIG- I, RIG- I and negatively regulates the signal pathway. The test results show that ubiquitination, GLTSCR2 through USP15, not USP3, USP21 or TRIM25, and then remove the ubiquitin chain K63 coupling RIG- 1, which the negative regulation of RIG- activation and IFN- beta 1. Finally, we will be truncated fragments of GLTSCR2 tandem penetrating peptides, construct G4-TAT gene, prokaryotic expression, cell test results showed that the recombinant protein G4-TAT can penetrate the cell membrane into the cell, inhibition of type I interferon signaling pathway negatively regulates antiviral response, which is conducive to the virus copy. In conclusion, GLTSCR2 can promote the replication of the virus, the virus infection from GLTSCR2 nuclear translocation to the cytoplasm, and through the recruitment of USP15 to RIG- I K63 a ubiquitin ubiquitin chain negative The activation of RIG- I negatively regulates the antiviral response of type I interferon, while the prokaryotic expression protein of GLTSCR2 carboxy terminal can also negatively regulate the production of type I interferon and promote the replication of virus.

【學位授予單位】：中國農業(yè)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：Q939.91;Q78

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本文編號：1391270