本文關鍵詞：明永冰川及其退卻地區(qū)垂直氣候帶的細菌群落多樣性研究　出處：《昆明理工大學》2016年博士論文　論文類型：學位論文

  更多相關文章： 明永冰川 垂直氣候帶 低溫微生物 細菌群落 多樣性

【摘要】：位于滇西北的明永冰川屬梅里雪山山系,深處我國青藏高原東南部生物多樣性最為豐富的橫斷山區(qū),是我國獨有的低緯度、高海拔季風性冰川,在水平距離不到15公里的范圍內(nèi),海拔垂直落差近5,000 m,其間無任何地理隔絕。在該分布區(qū)內(nèi),形成了完整的冰川-森林-干暖河谷垂直氣候帶,使得生物多樣性集中體現(xiàn)在一個非常狹窄的區(qū)域內(nèi)。本論文以明永冰川及其退卻地區(qū)垂直氣候帶的微生物生態(tài)分布為研究對象,重點對該地區(qū)細菌群落的組成和結構進行了研究。論文首先通過經(jīng)典微生物純培養(yǎng)方法,利用四種不同的培養(yǎng)基從明永冰川地區(qū)共分離得到37,513株細菌,根據(jù)菌落形態(tài)分為391株,分離到的絕大部分菌株能在4℃-37℃生長,少部分僅能在4℃-25℃生長。研究結果表明,寡營養(yǎng)培養(yǎng)基PYGV分離得到的細菌種類多于LB和Organnic等富營養(yǎng)培養(yǎng)基,表明PYGV針對冰川地區(qū)細菌的分離與鑒定更為合適。對分離得到的部分菌株進行了鑒定,結果表明分離到的菌株大部分為革蘭氏陰性菌,分布于4個菌門(變形菌門、放線菌門、厚壁菌門、擬桿菌門)、4個菌綱(丫-變形菌綱、放線菌綱、芽孢桿菌綱、黃桿菌綱)、7個菌目(假單胞菌目、腸桿菌目、黃胞單菌目、鏈霉菌亞目、微球菌亞目、芽孢桿菌目、黃桿菌目)、7個菌科(假單胞菌科、腸桿菌科、黃胞單菌科、鏈霉菌科、短桿菌科、芽孢桿菌科、黃桿菌科)和7個菌屬(假單胞菌屬(Pseudomonas)、耶爾森氏菌屬(Yersinia)、寡養(yǎng)單胞菌屬(Stenotrophomonas)、鏈霉菌屬(Streptomyces)、短桿菌屬(Brevibacterium)、芽孢桿菌屬(Bacillus)和黃桿菌屬(Flavobacterium)),其中假單胞菌屬最多,在已鑒定過的細菌中占比超過35%,其余6個屬的細菌占比不到65%。最后,以分離的部分細菌為宿主對該地區(qū)可培養(yǎng)低溫噬菌體進行了分離和性質研究,共分離得到6株在4℃仍然可以生長繁殖的低溫噬菌體,并對它們的性質進行了初步研究。為進一步探討針對該地區(qū)低溫細菌更精細的分類鑒定方法,論文根據(jù)細胞膜質組成受溫度影響顯著的特點,利用來源于三個不同氣候帶的12株可培養(yǎng)低溫細菌,通過氣相色譜法分析了它們在低溫培養(yǎng)條件下的膜不飽和脂肪酸組成情況,并以不飽和脂肪酸的組成對低溫菌做了聚類分析。研究結果表明,絕大部分的細菌分類結果與16S rRNA基因構建的進化關系一致,證明利用膜不飽和脂肪酸組成能對該地區(qū)的低溫細菌進行科學的分類。同時在研究中發(fā)現(xiàn)部分細菌利用新方法能得到比16S rRNA基因分析法更精細的分類地位,證明以膜質脂肪酸組成進行分類鑒定能更好的區(qū)分同一種屬的低溫細菌在親緣關系上的遠近。研究結果也同時證明了經(jīng)過選擇的這些低溫細菌細胞膜中的不飽和脂肪酸的比例與溫度成反比關系,即溫度越低,不飽和脂肪酸的含量越大。雖然大部分不飽和脂肪酸成分與已報道過的其它低溫細菌大致相同,但部分低溫細菌的脂肪酸組分并不相同,這一現(xiàn)象值得在今后進行進一步研究。為更客觀和全面地了解明永冰川地區(qū)不同垂直氣候帶細菌群落的組成和結構,論文采用16S rRNA基因V6高變區(qū)測序技術對明永冰川十一個樣點的土壤樣品的免培養(yǎng)細菌進行了檢測和分析。重點對分布于三個垂直氣候帶中的四個代表性樣品進行了分析。研究表明：在4個樣品中共包含了21個菌門,42個菌綱,79個菌目,主要優(yōu)勢菌群包括Proteobacteria、Deinococcus-Thermus、Firmicutes、 Actinobacteria和Nitrospirae等5個菌門。其中Verrucomicrobia菌門為明永冰川獨有,尚未在其它冰川微生物的研究中報道過。對不同氣候帶細菌群落組成通過16S rRNA基因V6高變區(qū)測序技術的分析表明,不同氣候帶的細菌組成主要在菌目這一級別就有顯著差異,部分氣候帶的細菌群落組成甚至在菌門、菌綱這一級別都表現(xiàn)出明顯差異,充分說明不同氣候帶細菌群落組成具有明顯的特征。在菌科、菌屬這一分類級別中,由于數(shù)量過于龐大反而難于歸納出各氣候帶的細菌群落組成特征。經(jīng)過對處于優(yōu)勢地位的細菌群落分析后證明：在菌屬這一級的分類中,棒狀桿菌屬(Corynebacteriu)、丙酸桿菌屬(Propionibacterium)和鏈球菌屬(Streptococcus)三個菌屬在各個氣候帶排名前十優(yōu)勢菌屬的組成上都有出現(xiàn),說明它們在該地區(qū)分布最為廣泛,與環(huán)境有較好的適應性。假單胞桿菌屬(Pseudomonas)的細菌在所有樣品中都有分布,但在排名前十的優(yōu)勢菌屬中只有寒溫帶與接近寒帶的樣品中可以發(fā)現(xiàn)它們,初步表明此屬細菌在低溫的環(huán)境下能更好的生長,是該區(qū)域的優(yōu)勢種群之一,這一結果也間接印證了該地區(qū)可培養(yǎng)細菌分離的結果。在論文的最后,我們利用宏基因組測序的方法對位于中溫帶與寒帶之間的寒溫帶的土壤樣品進行了分析,在16S rRNA基因V6高變區(qū)測序技術分析結果中,此氣候帶的細菌多樣性相對比較低,在優(yōu)勢細菌群落的組成上與相鄰的兩個氣候帶有較大不同。經(jīng)過對總量約30G的測序數(shù)據(jù)進行整理分析后表明,僅針對細菌的物種注釋該區(qū)域就發(fā)現(xiàn)了44個菌門和49個菌綱,證明了明永冰川地區(qū)有豐富的細菌多樣性。經(jīng)過對16S rRNA基因V6高變區(qū)的測序結果進行對比分析,發(fā)現(xiàn)主要的優(yōu)勢菌群在門、綱和目級三個分類級別中排名前十的細菌中,分別有6個菌門、5個菌綱和3個菌目組成相同,但是在具體到每個優(yōu)勢菌群所占比例上又有所差異,而在科或科以下的分類級別中,兩種方法中排名前十的優(yōu)勢菌種幾乎沒有一致性。造成這一差異的原因可能存在以下幾個方面：首先由于16SrRNA基因測序分析法必須經(jīng)過一個PCR擴增過程,而不同細菌模板DNA的擴增倍數(shù)不一樣,最佳擴增條件也可能不同；其次,兩種方法的物種注釋方法及數(shù)據(jù)庫存在有明顯的差別。總的來看,宏基因組測序所達到注釋物種的覆蓋率要遠遠大于16S rRNA基因V6高變區(qū)測序法所能達到的覆蓋率。表明該方法對復雜生態(tài)環(huán)境中微生物群落研究具有更好的覆蓋率,有利于更完整地體現(xiàn)特定生態(tài)環(huán)境中微生物的組成情況,只是該方法目前費用較高,從研究的經(jīng)濟性上有一定的限制。利用宏基因測序數(shù)據(jù)開展的代謝途徑研究中我們發(fā)現(xiàn)本區(qū)域細菌中的熱點信號通路多集中在了環(huán)境信息加工、遺傳信息加工和新陳代謝三個方面；而在相關功能模塊的統(tǒng)計中,在已知的功能基因中,氨基酸的運輸與代謝相關的基因、信號的轉導機制相關的基因和能量的生產(chǎn)和轉變相關的基因排在前三位,這與信號通路中的熱點基本吻合。對比各種方法得到的結果,純培養(yǎng)方法在11個采樣點分離得到的全部細菌來自于4個菌門,4個菌綱；免培養(yǎng)法的16S rRNA基因V6高變區(qū)高通量的測序分析在4個采樣點得到的全部序列則來自于21個菌門,42個菌綱；宏基因組方法在一個采樣點得到44個菌門,49個菌綱。從以上結果我們不難看出幾種方法在研究細菌群落分布上各有各的特點：純培養(yǎng)方法主要針對可培養(yǎng)微生物,在得到基本細菌組成的同時可以得到一批珍貴的可培養(yǎng)細菌,但得到的細菌種類受分離條件的限制,種類較少；而基于16S rRNA基因V6高變區(qū)的高通量測序分析的免培養(yǎng)法針對細菌,可以較為迅速和經(jīng)濟地得到一個區(qū)域內(nèi)細菌種群的組成與結構信息,但對該地區(qū)細菌相關代謝通路及功能基因則無法了解；而宏基因組學方法則可以較為詳細了解一個區(qū)域內(nèi)的物種組成、代謝通路和功能基因,而且該方法的物種注釋還可以擴展到除細菌外的其它微生物種群,有利于更全面地了解特定環(huán)境中所有生物群落的組成,但該方法依然受到檢測價格高、樣品總DNA的提取方法、測序手段的限制,而在得到海量數(shù)據(jù)后還受到生物信息分析技術、樣品復雜度和測序深度的影響,當然隨著技術的不斷進步,我們相信宏基因組分析方法將是未來進行環(huán)境群落和代謝分析的重要手段。論文通過純培養(yǎng)、免培養(yǎng)方法、膜不飽和脂肪酸組分分析法以及宏基因組等方法,對明永冰川不同氣候帶的細菌群落分布等進行了系統(tǒng)地調(diào)查和分析。首次從不同角度和尺度對低緯度、高海拔的明永冰川地區(qū)的細菌群落組成及多樣性進行了調(diào)查,并對各個不同的垂直氣候帶之間的細菌群落的分布使用多種方法進行了綜合研究。是從宏觀到微觀的一次系統(tǒng)性調(diào)查和資源收集,使得這一獨特地理環(huán)境的微生物生態(tài)研究更加系統(tǒng)化。論文首次利用氣相色譜法,根據(jù)膜不飽和脂肪酸組成的不同對該地區(qū)分離得到的12株低溫細菌開展了分類學方法的研究,結果表明該方法的結果不僅與基于16S rRNA基因序列分析得到的結果一致,而且相比后者更為精細,是對該地區(qū)微生物尤其是低溫細菌進行分類的一種重要方法,該方法也可望用于其它地區(qū)低溫細菌的精細分類。研究中還分離得到了一批可培養(yǎng)的低溫噬菌體及其宿主菌,積累了大量的微生物資源,為今后在實驗室中進一步開展噬菌體的低溫適應性機制、噬菌體與宿主的相互作用及噬菌體與宿主的協(xié)同進化機制等研究提供了珍貴的實驗材料。本研究的結果不僅使得這一獨特地理環(huán)境地區(qū)的微生物生態(tài)研究更加系統(tǒng)化,也為進一步在該地區(qū)開展生物地球化學、微生物生態(tài)學及挖掘微生物資源奠定了基礎。
[Abstract]:Located in the northwest of Yunnan Mingyong Glacier belongs to the Meili Xue Shan mountains, the depths of our country southeast of the Tibetan Plateau biodiversity is most abundant in the Hengduan Mountains, is China's unique low latitude and high altitude monsoon glaciers, horizontal distance in the range of less than 15 kilometers, the elevation drop of nearly 5000 m, there is no any geography isolated. In the distribution area, the formation of a complete glacier - Forest - dry warm valley vertical climatic zones, the biodiversity is reflected in a very narrow range. In this paper, Mingyong Glacier and retreat area vertical climatic zones of microbial ecological distribution as the research object, the composition and structure of bacteria community in the region was studied. Firstly, through the method of classic pure culture microorganisms, using four different kinds of culture medium from Mingyong Glacier area 37513 bacteria strains were isolated, divided into 391 strains according to the colony morphology, 鍒嗙鍒扮殑緇濆ぇ閮ㄥ垎鑿屾牚鑳藉湪4鈩，

本文編號：1368332