本文關(guān)鍵詞：RUNX1T1在海馬放射狀膠質(zhì)細(xì)胞向神經(jīng)元分化中的作用　出處：《蘇州大學(xué)》2016年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：RUNX1T1又稱為MTG8或ETO,作為重要的轉(zhuǎn)錄因子參與各個系統(tǒng)的發(fā)育調(diào)控。目前,RUNX1T1在白血病發(fā)病機制方面的研究較多,而在神經(jīng)系統(tǒng)中的作用研究甚少,主要認(rèn)為該因子可作為共抑制子參與神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過程中細(xì)胞的增殖和向神經(jīng)元分化。為研究RUNX1T1在海馬神經(jīng)再生中調(diào)控海馬放射狀膠質(zhì)細(xì)胞向神經(jīng)元分化的作用,本研究主要探討RUNX1T1在海馬神經(jīng)再生中所起的作用。一目的:觀察海馬神經(jīng)再生微環(huán)境刺激下,“激活”的星形膠質(zhì)細(xì)胞自身發(fā)生的變化及對海馬神經(jīng)再生的影響;觀察切割穹窿海馬傘海馬中RUNX1T1 m RNA和蛋白表達(dá)的時相變化及其定位;體外模擬海馬神經(jīng)再生微環(huán)境,觀察海馬放射狀膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)RUNX1T1以及向神經(jīng)元分化情況;體外沉默和過表達(dá)RUNX1T1后對海馬放射狀膠質(zhì)細(xì)胞分化為神經(jīng)元的影響;體內(nèi)沉默和過表達(dá)RUNX1T1后對海馬神經(jīng)再生的影響,明確RUNX1T1與海馬神經(jīng)再生的關(guān)系。二方法:(1)切割大鼠雙側(cè)穹窿海馬傘并且制備正常及切割穹窿海馬傘海馬提取液;(2)體外培養(yǎng)星形膠質(zhì)膠質(zhì),在培養(yǎng)液中加入正常及切割穹窿海馬傘海馬提取液,“激活”星形膠質(zhì)膠質(zhì),檢測其共表達(dá)BLBP、Vimentin、Nestin、Sox2與GFAP的情況;(3)制備“激活”的星形膠質(zhì)膠質(zhì)條件培養(yǎng)基,培養(yǎng)海馬NSCs,檢測NSCs的存活、遷移和分化為神經(jīng)元的情況;(4)ELISA檢測條件培養(yǎng)基中聚集素蛋白(Clusterin,CLU)的含量,體外檢測Clusterin蛋白誘導(dǎo)海馬NSCs向神經(jīng)元分化的情況;(5)制備切割右側(cè)穹窿海馬傘大鼠模型,分別于術(shù)后第3d、7d、14d、21d、28d檢測RUNX1T1 m RNA和蛋白表達(dá)情況;(6)體外培養(yǎng)海馬RGCs,在培養(yǎng)液中加入正常和切割海馬提取液,觀察海馬提取液促進(jìn)RGCs表達(dá)RUNX1T1以及向神經(jīng)元分化的作用;(7)將si RNA-RUNX1T1干擾慢病毒和LV-RUNX1T1-overexpression過表達(dá)慢病毒分別轉(zhuǎn)染至體外培養(yǎng)的海馬RGCs中,檢測海馬RGCs中RUNX1T1 m RNA和蛋白表達(dá),以及向神經(jīng)元分化情況;(8)將si RNA-RUNX1T1干擾慢病毒注入切割穹窿海馬傘大鼠海馬齒狀回中,觀察海馬齒狀回中新生DCX陽性神經(jīng)元的情況;(9)將LV-RUNX1T1-overexpression過表達(dá)慢病毒注入正常大鼠海馬齒狀回中,觀察海馬齒狀回中新生DCX陽性神經(jīng)元的情況。三結(jié)果:(1)切割穹窿海馬傘大鼠海馬提取液“激活”的星形膠質(zhì)細(xì)胞,膠質(zhì)前體細(xì)胞的標(biāo)記物BLBP、Vimentin和神經(jīng)干細(xì)胞的標(biāo)記物Nestin、Sox2表達(dá)顯著增強,出現(xiàn)較多的Nestin+/GFAP+細(xì)胞和Sox2+/GFAP+細(xì)胞;(2)“激活”星形膠質(zhì)細(xì)胞的條件培養(yǎng)基培養(yǎng)的海馬神經(jīng)干細(xì)胞球,球內(nèi)細(xì)胞的存活和發(fā)育狀態(tài)明顯較好;在膜穿孔實驗中,用“激活”星形膠質(zhì)細(xì)胞的條件培養(yǎng)基誘導(dǎo)的海馬神經(jīng)干細(xì)胞,其發(fā)生遷移的數(shù)量顯著較多;并出現(xiàn)更多數(shù)量的海馬神經(jīng)干細(xì)胞分化成MAP-2陽性神經(jīng)元,且神經(jīng)元的突起也長而豐富;(3)對制備的各組條件培養(yǎng)基進(jìn)行ELISA檢測,結(jié)果顯示切割組12h、24h、48h中的Clusterin蛋白濃度均明顯高于對照組和正常組,其中切割24h組達(dá)到它們的4倍;利用Clusterin在體外誘導(dǎo)海馬神經(jīng)干細(xì)胞分化,觀察到Clusterin能明顯促進(jìn)更多的海馬神經(jīng)干細(xì)胞向神經(jīng)元分化,并且分化的神經(jīng)元與空白對照組相比,其突起更長、更豐富;(4)切割穹窿海馬傘后不同時間點,海馬組織中RUNX1T1的表達(dá)水平發(fā)生了變化,在切割3d組中RUNX1T1 m RNA和蛋白的表達(dá)明顯上調(diào),并達(dá)到高峰,此后迅速下降;免疫熒光檢測進(jìn)一步顯示,在海馬齒狀回中RUNX1T1陽性細(xì)胞主要分布于顆粒下層,在正常組中僅見少量的RUNX1T1陽性細(xì)胞,切割3d組中RUNX1T1陽性細(xì)胞數(shù)迅速增加,并達(dá)到高峰,在7d組,RUNX1T1陽性細(xì)胞數(shù)逐漸減少,21d組,基本恢復(fù)到正常水平;(5)用切割穹窿海馬傘海馬提取液培養(yǎng)海馬RGCs,體外模擬海馬再生微環(huán)境,結(jié)果觀察到“激活”的海馬RGCs中RUNX1T1 m RNA和蛋白的表達(dá)量均明顯上調(diào),分別約為2.9倍和2.4倍,并且更多的海馬RGCs可向MAP-2陽性神經(jīng)元分化;(6)在RUNX1T1-RNAi有效地下調(diào)海馬RGCs中RUNX1T1的表達(dá)后,觀察到僅有3.20%±2.31%細(xì)胞分化成MAP-2陽性神經(jīng)元,明顯少于對照組和空病毒組,而且細(xì)胞突起也明顯較短、較少。相反,用過表達(dá)慢病毒LV4-RUNX1T1-overexpression轉(zhuǎn)染海馬RGCs,上調(diào)海馬RGCs中RUNX1T1的表達(dá),28.31%±5.05%細(xì)胞表達(dá)MAP-2,與對照組和空病毒組相比,陽性細(xì)胞數(shù)量明顯明顯增多,細(xì)胞突起顯著變長而豐富;(7)將構(gòu)建的si RNA-RUNX1T1干擾慢病毒載體注入切割穹窿海馬傘海馬齒狀回中,檢測到海馬中RUNX1T m RNA及蛋白的表達(dá)顯著下調(diào),海馬齒狀回中新生的DCX陽性神經(jīng)元數(shù)也明顯減少;而在正常海馬齒狀回中注射LV-RUNX1T1過表達(dá)慢病毒載體,上調(diào)RUNX1T m RNA及蛋白的表達(dá),則觀察到更多的新生DCX陽性神經(jīng)元,細(xì)胞的突起更長更豐富。四結(jié)論:(1)切割穹窿海馬傘大鼠海馬提取液“激活”的星形膠質(zhì)細(xì)胞,高表達(dá)膠質(zhì)前體細(xì)胞標(biāo)記物和神經(jīng)干細(xì)胞標(biāo)記物,逆轉(zhuǎn)化成放射狀膠質(zhì)細(xì)胞,具有胚胎源性;(2)“激活”的星形膠質(zhì)細(xì)胞可促進(jìn)海馬神經(jīng)干細(xì)胞存活、遷移和向神經(jīng)元分化;(3)“激活”的星形膠質(zhì)細(xì)胞分泌更多的Clusterin蛋白,從而促進(jìn)海馬神經(jīng)干細(xì)胞向神經(jīng)元分化;(4)穹窿海馬傘切割后海馬內(nèi)RUNX1T1 m RNA和蛋白表達(dá)在早期呈短暫性上調(diào),并定位于海馬齒狀回顆粒下層;(5)切割穹窿海馬傘海馬提取液促進(jìn)RGCs上調(diào)RUNX1T1和向神經(jīng)元分化(6)體外下調(diào)RGCs中RUNX1T1的表達(dá),可抑制RGCs分化成MAP-2陽性神經(jīng)元;而上調(diào)RUNX1T1在RGCs中的表達(dá),則能促進(jìn)更多的RGCs向MAP-2陽性神經(jīng)元分化;(7)海馬內(nèi)RUNX1T1的表達(dá)水平可調(diào)控海馬齒狀內(nèi)的神經(jīng)再生。
[Abstract]:In order to study the role of RUNX1T1 in the development of hippocampus , the effects of RUNX1T1 on neuronal differentiation in hippocampus were studied . ( 4 ) To observe the expression of RUNX1T1 mRNA and protein in hippocampus , and to observe the expression of RUNX1T1 mRNA and protein in hippocampus dentate gyrus . ( 5 ) To observe the expression of RUNX1T1 mRNA and protein in hippocampus dentate gyrus . The expression levels of RUNX1T1 mRNA and protein in hippocampus were significantly higher than those in control group and normal group . Conclusion : ( 1 ) The expression of RUNX1T1 mRNA and protein in hippocampus can be regulated and the expression of RUNX1T m RNA and protein can be regulated in hippocampus dentate gyrus .

【學(xué)位授予單位】：蘇州大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R338
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本文編號：1361862