本文關鍵詞：G-四鏈體結構的質譜光譜性質研究　出處：《吉林大學》2016年博士論文　論文類型：學位論文

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【摘要】：G-四鏈體是一種特殊的核酸二級結構形態(tài),它是由富含鳥嘌呤的DNA、RNA或者核酸類似物組成的核酸高級結構。目前,人們已經獲得了大量實驗數(shù)據(jù)證明潛在形成G-四鏈體的核酸序列存在于真核生物乃至人體中,并且在生物體中起到了非常重要的生物功能調節(jié)的作用。G-四鏈體的構成不同于經典雙螺旋結構,在雙螺旋結構中,腺嘌呤(A)與胸腺嘧啶(T)通過氫鍵連接形成A-T堿基互補配對,鳥嘌呤與胞嘧啶通過氫鍵形成G-C堿基互補配對,而在G-四鏈體結構單元中,4個鳥嘌呤通過Hoogsteen氫鍵作用形成環(huán)狀平面結構稱為G-四分體,再通過G-四分體的相互堆積作用進一步形成G-四鏈體結構。G-四鏈體的結構受到很多因素的影響,如序列中富G序段(G-tract)長度和位置以及其他堿基的組成和數(shù)量、與序列相互作用的離子的種類以及小分子配體(ligands)與G-四鏈體的非共價相互作用等等。正是由于G-四鏈體結構受到眾多內部外部因素的控制,其最終結構呈現(xiàn)出極其豐度的結構多態(tài)性使得研究者難以對未知序列的結構進行預測。鑒于G-四鏈體的結構特殊性以及G-四鏈體在生物體中重要的生物學意義,研究序列變化對G-四鏈體結構形態(tài)的影響并進一步了解結構變化規(guī)律能夠指導人們認識G-四鏈體在生物體內的形態(tài)以及合成相應小分子藥物穩(wěn)定G-四鏈體。目前G-四鏈體結構的研究熱點主要集中在其生物功能表達和與G-四鏈結構相關的大分子功能性材料的構建,對于G-四鏈體結構基礎性的研究相對較少。由于G-四鏈體在結構鑒定方面的困難,目前國際主流的研究方法依然集中在利用X射線晶體衍射法和核磁共振波譜法確認和區(qū)分核酸G-四鏈體結構。雖然已經有一部分結構得到了解析,但是仍急需開發(fā)更多便捷快速的結構鑒定方法。利用質譜手段結合光譜技術對G-四鏈體結構進行鑒別的難度較大,相關研究較少,因此在這方面如果能夠尋求突破,對于G-四鏈體結構分析將會做出重要貢獻。因此,本文作者在前人的研究基礎上,主要著眼于開發(fā)G-四鏈體結構分析中光譜法與質譜法的結合,如何將質譜的高靈敏,高通量,快速鑒定的方法結合光譜學的特性應用到G-四鏈體結構生物學鑒定中來,本論文的實驗內容主要有如下幾個方面:1.利用G-四鏈體的自發(fā)熒光特性研究處于不同結構狀態(tài)下的G-四鏈體的發(fā)射熒光性質,通過對比不同類型結構產生的發(fā)射熒光,將具體結構性質與相應光譜性質進行對應,建立結構與熒光光譜特征的直接關系。前人通過實驗證明平行雙分子堆積G-四鏈體結構在260nm波長激發(fā)條件下可以產生385nm的熒光發(fā)射峰,理論計算結果證明特征峰產生的原因在于結構中堆積界面處鳥嘌呤之間芳香環(huán)堆積(aromatic overlaps)。為此我們選擇了一系列富含鳥嘌呤的特征序列來研究G-四鏈體的自發(fā)熒光特征。被研究序列的液相結構以及結構中的鳥嘌呤堆積形態(tài)已經得到確認,我們選取合適濃度將序列充分擬合形成結構后在260nm波長下激發(fā)并考察它們的熒光發(fā)射性質。實驗結果證明平行結構G-四鏈體可以產生特殊的熒光發(fā)射信號尤其是當結構中存在著5'-5'堆積,而且證明堆積界面的部分五/六芳香環(huán)堆積(partial 5/6-ring overlaps)不是產生385nm熒光發(fā)射的唯一方式;同時結構中的反式-反式鳥嘌呤堆積也可以產生微弱的熒光發(fā)射信號;特殊的高級多分子鎖定結構還能夠產生330nm和385nm的熒光發(fā)射峰。我們建立了具體結構形態(tài)和熒光發(fā)射之間的關系,對于結構進一步區(qū)分和預測具有重要意義。2.我們利用電噴霧質譜結合熒光光譜法、圓二色譜法、紫外吸光光度法以及非變性凝膠電泳法研究了互鎖式雙分子結構93del和其衍生序列的結構特性。通過與堆積式結構的對比我們發(fā)現(xiàn),質譜法可以將互鎖式與堆積式結構進行區(qū)分。我們的研究結果表明,環(huán)長度、5'-端殘基、以及富G序段的位置均對互鎖結構產生重要的影響。這一研究不僅揭示了部分(3+1)型互鎖式結構的形成規(guī)律也進一步闡述了特定序列的形成過程。3.我們著重考察了非對稱型富含鳥嘌呤堿基的序列在形成G-四鏈體過程中的結構規(guī)律,其中(4n-1)、(4n-2)型G-四鏈體中均不同程度的出現(xiàn)了多分子聚集的情況,通過熒光方法我們確認了這些序列形成G-四鏈體混雜結構。下一步我們對核酸序列進行衍生化并系統(tǒng)研究了富含短GG序段的DNA序列形成G-四鏈體后在質譜以及光譜中的相關現(xiàn)象。對于以上序列的氣相液相實驗規(guī)律的總結,我們進一步認識了G-四鏈體結構中的特殊作用方式。然而,現(xiàn)階段無論使用G-四鏈體結構測試的經典方法,還是通過我們掌握的測試手段,解析文章中的某些多分子結構都有困難,因此在今后的研究中,我們也會著重開發(fā)更多了技術手段來研究G-四鏈體結構信息。4.我們著重研究了G-四鏈體核酸序列在質譜中的結構性質。為了研究高濃度下結構的轉化,首先我們重新優(yōu)化了儀器條件,最終通過調節(jié)四極桿離子能量和碰撞能量控制G-四鏈體單分子結構、雙分子結構分子離子峰的豐度。我們進一步證明了在氣相體系中,雙分子堆積G-四鏈體是穩(wěn)定性很好的結構形態(tài),對質譜中電場能量的耐受性很強,不容易失去核心銨離子。其次我們研究了高單鏈濃度條件下非平行序列的結構轉化,這種轉化程度很小,即使是高分辨質譜也必須在較高能量條件下才能觀察到,轉化后的結構為雙分子堆積G-四鏈體。最后我們對比了G-四鏈體的氣相穩(wěn)定性與其液相穩(wěn)定性,證明二者之間可以相互印證,也為我們解釋氣相中結構提供了理論依據(jù)。
[Abstract]:G- four chain is a special form of nucleic acid of two level structure, which is composed of guanine rich nucleic acid structure composed of RNA DNA, a senior or nucleic acid analogues. At present, people have got a lot of experimental data to demonstrate the potential formation of nucleic acid sequence G- four chain bodies exist in eukaryotic organisms and the human body, and in the organism plays a role of the four strand.G- very important biological function of regulation is different from the classical double helix structure, the double helix, adenine and thymine (A) A-T (T) connected to form complementary base pairing through hydrogen bonding, guanine and cytosine hydrogen bonds formed by G-C base pairing, and in G- the four chain structure unit, 4 Hoogsteen guanine through hydrogen bonding to form a ring plane structure called G- four, and then through the mutual accumulation effect of G- four split further form G- four chain structure.G- four chain The structure is influenced by many factors, such as the sequence of G rich sequence segment (G-tract) length and position as well as other base composition and number of species and ion interaction and sequence of small molecule ligands (ligands) and G- four chain of non covalent interactions and so on. It is from the four G- chain structure controlled by many internal and external factors, the final structure presents the research the structural polymorphism of extremely abundance to the structure of the unknown sequence prediction. In view of the structure of G- four chain of special G- and four chain in organism important biological significance, effect of sequence variation on structure and morphology of G- four the chain body and further understand the changes of structure can help people understand the morphology of G- four chain bodies in organisms and the corresponding synthetic small molecule drug stabilized G- four chain. The current research focus of G- four chain structure of main body To construct the expression on its biological function and molecular chain structure and G- four related functional materials, for the study of G- four based chain structure of relatively less. Due to the difficulty of the four strand G- in structure identification, the current international mainstream research method is still concentrated confirmed by X ray diffraction and nuclear magnetic resonance spectroscopy in nucleic acid and distinguish the four strand G- structure. Although there have been a part of the structure have been derived, but still need to develop more efficient methods of structure identification by mass spectrometry. Methods to identify G- four chain structure combined with spectral technology is difficult, less relevant research, so in this respect if to seek a breakthrough in the G- four chain structure analysis will make an important contribution. Therefore, the author of this paper on the basis of previous studies, mainly focus on the development of spectral analysis G- four chain structure method In combination with mass spectrometry, mass spectrometry to sensitive, high-throughput, rapid identification of the binding characteristics of Applied Spectroscopy to G- four chain structure of biological identification to the contents of this paper are as follows: 1. using G- four chain autofluorescence characteristics in fluorescence emission properties of G- four the chain of different structures under the condition of the fluorescence emission produced by comparing different types of structure, the corresponding specific structural properties and the corresponding spectral properties, a direct relationship between the structure and fluorescence spectra. Previous experiments show that the parallel double fluorescent molecular packing G- four chain structure in 260nm wavelength excitation conditions can produce 385nm the emission peak, theoretical calculation results prove that the reason is the characteristic peak structure at the interface between the accumulation of guanine (aromatic overlaps) aromatic ring stacking. We chose a Autofluorescence characteristics of guanine rich sequence series to study the G- four chain body. Study the liquid phase structure and sequence structure of the guanine accumulation form has been confirmed, we will select the appropriate concentration of sequence fully fitted to form structure at 260nm wavelength excitation and investigate their fluorescence properties. The experimental results prove the parallel structure the four strand G- body can produce special fluorescent emission signals especially when the structure exists in the accumulation of 5'-5', but also that the accumulation of part of the interface five / six aromatic ring stacking (partial 5/6-ring overlaps) are not the only way to produce 385nm fluorescence emission; and trans - structure in trans guanine can also produce weak accumulation the fluorescence emission signal; advanced multi molecular special locking structure can also produce fluorescence emission peak of 330nm and 385nm. We established the specific structure and fluorescence The relationship between the emission, to further distinguish and structure prediction has important significance of.2. we use electrospray mass spectrometry combined with fluorescence spectroscopy, circular two chromatography of interlocking double molecular structure of 93del and its derivative sequence structural characteristics of UV spectrophotometry and non denaturing gel electrophoresis. By contrast with the accumulation of the structure we found that mass spectrometry can be interlocked with the stacked structure distinction. Our results show that the ring length, 5'- terminal residues, and the position of G rich segments all have important effects on the interlocking structure. This study not only revealed the formation of type (3+1) interlocking structure also further expounds the formation process of sequence specific.3. we focus on the study of asymmetric guanine rich sequences in the formation of base structure of G- four chain process, including (4N-1), (4n-2) G- type four chain The body had different degree appeared in a number of molecular aggregation, by fluorescence method we confirmed these sequences form G- four chain of hybrid structure. The next step we studied the DNA sequences of short GG segments and rich system of nucleic acid sequences derived form G- four chain in mass spectrometry and related phenomena in the spectrum. For the above sequence of gas and liquid phase experimental summary of the law, we further understand the special role of G- four chain structure. However, the classical method whether using G- structure four chain test stage, or through the test means we know, some molecular structure analysis in the article there are difficulties, so in the future study, we will focus on the development of more technical means to study the G- four chain structure information.4. we mainly study the structure of G- four chain of nucleic acid sequences in the mass spectrometry. The study on the transformation of structure under high concentration, we re optimize the conditions of the instrument, finally by adjusting the quadrupole ion energy and collision energy control of G- four single chain molecular structure, molecular structure, molecular ion abundance double peaks. We further prove that in the gas phase system, double molecular packing G- four chain structure form a good stability, strong resistance to electric energy mass, not easy to lose the core of ammonium ion. Secondly, we study the structure transformation of non parallel sequence ssDNA concentration conditions, the conversion degree is very small, even the high resolution mass must also be in high energy conditions can be observed, the structure transformation the double molecular packing G- four chain. Finally we compared the phase stability of G- four chain gas and its liquid phase stability, that between the two can confirm each other, but also for our interpretation of the gas phase structure. The theoretical basis is provided.

【學位授予單位】：吉林大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：Q52;O657.63

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