本文關(guān)鍵詞：新型核糖醇脫氫酶的克隆表達(dá)、性質(zhì)及其合成阿洛糖醇的應(yīng)用研究　出處：《江南大學(xué)》2017年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

  更多相關(guān)文章： 核糖醇脫氫酶 甲酸脫氫酶 產(chǎn)堿普羅威登斯菌 核酮糖 阿洛糖醇 D-阿洛酮糖

【摘要】：糖醇是由糖衍生的有機化合物,含有多種多元醇。由于其所含熱量比糖類低,因此被廣泛應(yīng)用于食品中。阿洛糖醇是一種含有6個碳原子的稀有單糖醇,也是D-阿洛酮糖還原途徑的主要產(chǎn)物,具有多重生理功能,例如其潤腸通便的功能可應(yīng)用于治療便秘,抑制脂質(zhì)堆積的功效可用于抑制肥胖。阿洛糖醇也可以用作抗結(jié)晶劑。此外,阿洛糖醇可以交聯(lián)D-和L-型己糖,在L-阿洛酮糖生產(chǎn)過程中發(fā)揮重要作用。微生物全細(xì)胞反應(yīng)和酶促反應(yīng)多適用于將D-型糖轉(zhuǎn)換為其他種類的糖。核糖醇脫氫酶(核糖醇:NAD+2-氧化還原酶;RDH;EC 1.1.1.56),可催化核糖醇轉(zhuǎn)化生成D-核酮糖且可催化D-阿洛酮糖轉(zhuǎn)化生成阿洛糖醇。本研究將來源于產(chǎn)堿普羅威登斯菌Providencia alcalifaciens RIMD 1656011的新型核糖醇脫氫酶基因在大腸桿菌Escherichia coli BL21中成功進行了克隆表達(dá)。本論文的目的是純化和表征P.alcalifaciens RIMD 1656011來源的核糖醇脫氫酶,并研究其底物特異性及作為工業(yè)用酶的潛力。利用鎳柱親和層析得到純酶,通過SDS-PAGE和LC-MS分析發(fā)現(xiàn)純酶的分子量在25 000～26 650 Da之間�；钚悦傅姆肿恿�(104k Da)研究表明該酶以四聚體形式存在時具有活性。該酶最適p H為10.0,最適溫度為35°C;熱穩(wěn)定性分析顯示,在25、30、40、50°C孵育4 h后,原始酶分別能夠保留72、72、48、0%的酶活。以核糖醇為底物,該酶的動力學(xué)參數(shù)Km和kcat值分別為13.9 mmol L-1和10.0 s-1,其催化效率(kcat/Km)為0.71 mmol L-1 s-1;NAD+的Km為0.042 mmol L-1。此外,底物特異性研究表明來源于P.alcalifaciens RIMD 1656011的核糖醇脫氫酶能夠直接轉(zhuǎn)化D-果糖生成阿洛糖醇且無副產(chǎn)物生成。在最優(yōu)生產(chǎn)條件下,D-阿洛酮糖合成阿洛糖醇需要組合使用來源于P.alcalifaciens的核糖醇脫氫酶(RDH)和甲酸脫氫酶(FDH)。將RDH和FDH基因克隆導(dǎo)入到p ET-22b(+)質(zhì)粒上,然后在大腸桿菌中進行表達(dá),生產(chǎn)得到相對應(yīng)的酶,并通過優(yōu)化反應(yīng)溫度、p H、轉(zhuǎn)速(75、100、125、150 rpm)和振蕩方式(水平和渦旋)來提高阿洛糖醇的產(chǎn)量。酶反應(yīng)的最適p H和溫度分別為7.5和40°C。研究表明,阿洛糖醇的收率隨轉(zhuǎn)速增加而顯著提高,在轉(zhuǎn)速150 rpm條件下反應(yīng)6 h后獲得最高收率95.60±0.54%。當(dāng)水平振蕩反應(yīng)時,阿洛糖醇的收率從100±6.05(無振蕩)增加到124.20±9.70%。在最優(yōu)條件下反應(yīng)6h,20 mg D-阿洛糖可還原生成16.7±0.62 mg阿洛糖醇,且在反應(yīng)過程中和結(jié)束后均無副產(chǎn)物的生成。利用高效液相色譜(HPLC)、紅外光譜(FT-IR)、液相色譜-質(zhì)譜(LC-MS)、核磁共振光譜(NMR)分析進行產(chǎn)物鑒定,確定最終分離得到的產(chǎn)物為阿洛糖醇,其純度為95%。此外,阿洛糖醇的熱穩(wěn)定性質(zhì)通過差示掃描量熱法(DSC)進行測定。因此,以D-阿洛糖為底物,通過組合使用RDH和FDH雙酶可成功生成阿洛糖醇。通過同源建模和分子對接研究了來自于P.alcalifaciens RIMD 1656011的核糖醇脫氫酶(RDH),該酶可用于生產(chǎn)阿洛糖醇。將RDH的蛋白質(zhì)序列通過Swiss Model進行同源建模后,使用Auto Dock Vina軟件(5.6版)將獲得的三維模型與NAD+和D-阿洛酮糖分別進行分子對接。同源建模和對接的結(jié)果顯示,RDH和NAD+反應(yīng)的保守氨基酸殘基是Tyr 153、Tyr 92、Ser 17和lys 157,而和D-阿洛酮糖反應(yīng)的保守氨基酸殘基為Gln 67和Asp 61。NAD+和RDH相互作用的得分為-49.84,表明結(jié)果較好。輔因子再生是近期的研究熱點,目前已經(jīng)發(fā)展了多種方法。工業(yè)輔因子再生過程中,酶反應(yīng)是最常用的方法。甲酸脫氫酶(FDH)是一種催化甲酸氧化成二氧化碳(CO2)的酶。它是NAD+依賴型酶,能使NAD+再生成NADH。本論文研究了利用甲酸脫氫酶從NAD+到NADH的再生過程,并通過同源建模和分子對接探索其酶激活位點,研究對象為來源于Ogataea parapolymorpha DL-1的甲酸脫氫酶。將FDH的蛋白序列通過Swiss Model軟件進行同源建模,然后采用Auto Dock Vina軟件將得到的三維結(jié)構(gòu)與NAD+進行對接。同源建模和對接的結(jié)果表明,FDH與NAD+相互作用的氨基酸殘基主要是Pro 68、Arg 258、Asn119、Asn 228和His 97。輔因子NAD+和FDH有很好的相互作用,得分為-60.23,表明結(jié)果較好。本研究將阿洛糖醇合成途徑和輔因子再生系統(tǒng)在大腸桿菌中進行重構(gòu),成功獲得通過還原D-阿洛酮糖生產(chǎn)阿洛糖醇的工程菌株。將來源于P.alcalifaciens的核糖醇脫氫酶基因和來源于O.parapolymorpha的甲酸脫氫酶基因進行共表達(dá),分別構(gòu)建阿洛糖醇的產(chǎn)生途徑及持續(xù)供應(yīng)NADH輔因子的再生系統(tǒng)。D-阿洛酮糖經(jīng)共表達(dá)菌株全細(xì)胞轉(zhuǎn)化48 h后,阿洛糖醇得率為96%,轉(zhuǎn)化的最適溫度、最適p H、D-阿洛酮糖濃度及生物量濃度分別為30°C、7.0、1%、OD600=40。綜上所述,該大腸桿菌代謝工程菌可用于大規(guī)模生產(chǎn)阿洛糖醇,并有著巨大的應(yīng)用前景。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：江南大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：Q55;TS202.3

【相似文獻】

相關(guān)期刊論文 前6條

1 李良智;尤吉;王偉;扶教龍;;核糖醇發(fā)酵工藝研究[J];生物技術(shù);2011年01期

2 李良智;楊天逸;李小林;扶教龍;胡翠英;;弗氏葡糖桿菌產(chǎn)核糖醇脫氫酶研究[J];生物技術(shù);2012年06期

3 詹伊婧;徐錚;許露;李莎;徐虹;;L-核糖的生產(chǎn)研究進展[J];生物加工過程;2013年05期

4 沐萬孟;張龍濤;江波;張濤;;D-阿洛糖的功能及生物轉(zhuǎn)化生產(chǎn)研究進展[J];安徽農(nóng)業(yè)科學(xué);2007年32期

5 周澤揚,作田莊平,山田靖宙,向仲懷;幾丁質(zhì)酶抑制物alosamidin中所含天然N─乙�；─氨基阿洛糖的生成機制探討[J];中國抗生素雜志;1996年04期

6 柏瑋;朱sッ，

本文編號：1355442