發(fā)布時間：2017-12-30 09:50

  本文關(guān)鍵詞：組織工程神經(jīng)修復(fù)周圍神經(jīng)缺損過程中血管生成的實驗研究　出處：《蘇州大學(xué)》2016年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：目的:運用形態(tài)學(xué)觀察方法及基因芯片檢測的大數(shù)據(jù)分析方法,觀察和分析體外構(gòu)建的組織工程神經(jīng)體內(nèi)修復(fù)周圍神經(jīng)缺損過程中血管生成的自然生物學(xué)過程,并研究和探討其血管生成關(guān)鍵調(diào)控基因和內(nèi)在分子調(diào)控機制。方法:1.體外構(gòu)建組織工程神經(jīng)。成功制備冷凍干燥的殼聚糖神經(jīng)導(dǎo)管的基礎(chǔ)上;以大鼠皮膚來源祖細胞(SKPs)分化的施萬細胞(SKP-SCs)為支持細胞,內(nèi)置絲素纖維的殼聚糖導(dǎo)管為支架材料,在旋轉(zhuǎn)灌注式細胞培養(yǎng)系統(tǒng)(RCCS)中體外構(gòu)建組織工程神經(jīng)。構(gòu)建好的組織工程神經(jīng)用生理鹽水(NS)漂洗兩次,于NS中保存?zhèn)溆谩?.制備坐骨神經(jīng)缺損模型。SPF級雌性SD大鼠隨機分為4組:TENG(組織工程神經(jīng))組,Autograft(自體神經(jīng))組,Scaffold(殼聚糖神經(jīng)導(dǎo)管)組,Sham(假手術(shù))組。實驗設(shè)1d、4d、1w、2w、3w、4w、8w和12w共8個時間點。常規(guī)手術(shù)制備大鼠坐骨神經(jīng)10mm缺損模型。3.體視顯微鏡觀察和拍照。動物麻醉后,游離并充分暴露橋接的組織工程神經(jīng)或自體神經(jīng)(每個時間點:TENG組n=3,Autograft組n=3)。組織工程神經(jīng)或自體神經(jīng)整體置于體視顯微鏡視野內(nèi)進行觀察,聚焦其表面血管進行拍照。4.HE染色和拍照。體視顯微鏡拍照完畢后,取出手術(shù)側(cè)組織工程神經(jīng)及橋接段自體神經(jīng)(每個時間點:TENG組n=3,Autograft組n=3)。動物標本經(jīng)過固定、切片,進行HE染色。光鏡下對組織工程神經(jīng)和自體神經(jīng)中段的內(nèi)部血管進行觀察和拍照。5.Micro-CT掃描、血管重建及參數(shù)分析。動物麻醉后,進行MICROFIL造影劑灌注(術(shù)后4w:TENG組n=3,Autograft組n=3)。造影劑固化后,分離并取出手術(shù)側(cè)組織工程神經(jīng)及橋接段自體神經(jīng)。透明處理的組織標本,體視顯微鏡下觀察;選取血管造影劑灌注充分的標本進行Micro-CT掃描、血管圖像重建及參數(shù)分析。6.基因芯片檢測及大數(shù)據(jù)分析。動物麻醉后,快速分離并取出各組手術(shù)側(cè)橋接段組織(Sham組為相同部位坐骨神經(jīng))(術(shù)后各時間點:TENG組n=9,Autograft組n=9,Scaffold組n=9,Sham組n=9;每組各時間點三只動物標本做成一支混合管)。組織標本進行RNA提取及基因芯片檢測。基因芯片數(shù)據(jù)進行“血管相關(guān)”基因分析。7.Real-time RT-PCR檢測及數(shù)據(jù)分析。動物麻醉后,快速分離并取出組織標本(術(shù)后各時間點:TENG組n=3,Autograft組n=3,Scaffold組n=3,Sham組n=3;每組各時間點三只動物標本做成一支混合管)。組織標本進行RNA提取、逆轉(zhuǎn)錄及關(guān)鍵基因RT-q PCR檢測。8.免疫熒光染色和拍照。選取血管出芽生長過程顯著時間點(TENG組n=3,Autograft組n=3),挑選其關(guān)鍵調(diào)控基因。組織切片進行免疫熒光染色和拍照,關(guān)鍵蛋白與血管內(nèi)皮細胞共同染色,以定位相互空間關(guān)系。結(jié)果:1.體視顯微鏡大體觀察表面血管。TENG組術(shù)后4d見血管從組織工程神經(jīng)兩端長入,2w血管布滿組織工程神經(jīng)表面;Autograft組術(shù)后1w、2w血管明顯增多。2.HE染色光鏡下觀察內(nèi)部血管。TENG組術(shù)后1w管壁內(nèi)出現(xiàn)成熟血管管腔,2w管壁內(nèi)血管明顯增多;術(shù)后1w再生組織內(nèi)部可見較多血管,2w-12w再生組織內(nèi)部均可見大量血管。Autograft組術(shù)后1d、4d神經(jīng)組織內(nèi)部即可見血管,隨后數(shù)量增多且各時間點無明顯變化。3.Micro-CT掃描血管重建。TENG組和Autograft組均可見大量微血管,以及聯(lián)通近遠側(cè)的血管。TENG組血管主要從近側(cè)端、遠側(cè)端和中間部分三個方向長入。4.血管重建圖像參數(shù)量化分析。TENG組和Autograft組相比,平均血管直徑TENG組明顯小于Autograft組(p0.05);血管數(shù)量、聯(lián)通性和空間分布等參數(shù)無統(tǒng)計學(xué)差異(p0.05)。兩組均主要為微血管和毛細血管,TENG組較之Autograft組,血管直徑相對較細,但分布范圍更廣。5.基因芯片數(shù)據(jù)聚類分析。TENG組、Autograft組和Scaffold組每個時間點三個樣本基因表達數(shù)值重復(fù)性均較好,其中術(shù)后1d基因表達數(shù)值與其余時間點數(shù)值相對獨立。6.基因芯片數(shù)據(jù)主成分分析。TENG組、Autograft組和Scaffold組術(shù)后1d為一個階段,離其余各時間點距離較遠;術(shù)后4d、1w、2w、3w、4w、8w和12w為第二階段,相互距離較近。7.基因芯片差異表達基因數(shù)目分析。TENG組和Scaffold組上下調(diào)差異基因數(shù)目,術(shù)后1w開始明顯增加;Autograft組上下調(diào)差異基因數(shù)目,術(shù)后各時間點變化不大,趨于平穩(wěn)。TENG組和Scaffold組更為相似,與Autograft組略有不同。8.基因芯片數(shù)據(jù)生物學(xué)過程分析。TENG組、Autograft組和Scaffold組血管生成均包括“缺氧啟動”(術(shù)后1d)、“血管出芽生長”(術(shù)后4d-3w)和“血管重塑”(術(shù)后4w-12w)三個大的階段;TENG組較之Autograft組和Scaffold組,更有利于血管出芽生長(出現(xiàn)時間更早)和血管重塑(持續(xù)時間更長)的發(fā)生。9.血管生成主要基因維恩圖分析。從基因具體參與情況看,Scaffold組細胞缺氧反應(yīng)較之TENG組和Autograft組更為顯著;TENG組和Autograft組血管出芽生長更相近;TENG組(兩個時間點)和Scaffold組血管重塑更為顯著。10.血管生成關(guān)鍵基因分析。細胞對缺氧的反應(yīng),UCN2在TENG組和Autograft組發(fā)揮關(guān)鍵作用,PTGS2在Scaffold組發(fā)揮重要作用。血管出芽生長,VEGFA和E2F8在TENG組發(fā)揮關(guān)鍵作用,SEMA3E在Autograft組發(fā)揮重要作用。血管重塑,DBH在TENG組和Scaffold組發(fā)揮關(guān)鍵作用,CSRP3在Autograft組發(fā)揮重要作用。11.血管生成主要基因動態(tài)調(diào)控分析。血管出芽生長,較之Autograft組,TENG組和Scaffold組表達變化基因更多;TENG組和Autograft組到后期差異基因開始減少,總體呈現(xiàn)先增加后回落的趨勢;Scaffold組到后期差異基因沒有明顯減少趨勢。血管重塑,較之Autograft組,TENG組和Scaffold組表達變化基因更多;Autograft組到后期差異基因開始減少,總體呈現(xiàn)先增加后回落的趨勢;TENG組和Scaffold組到后期差異基因沒有明顯減少趨勢。12.Real-time RT-PCR檢測分析。血管生成過程中細胞對缺氧的反應(yīng)、血管出芽生長以及血管重塑的關(guān)鍵參與基因,RT-q PCR檢測結(jié)果與基因芯片檢測結(jié)果兩者基因隨時間變化表達趨勢相似,具有較好的相關(guān)性。13.免疫熒光染色分析。血管出芽生長過程最為顯著的時間點,關(guān)鍵基因VEGFA(TENG組術(shù)后4d)、E2F8(TENG組術(shù)后1w)和SEMA3E(Autograft組術(shù)后2w)均有翻譯表達且和血管內(nèi)皮細胞共定位表達,表明其在血管出芽生長過程中發(fā)揮主要作用。結(jié)論:1.周圍神經(jīng)再生過程中,血管生成包括“缺氧啟動”、“血管出芽生長”和“血管重塑”三個主要階段。2.組織工程神經(jīng)和自體神經(jīng)橋接修復(fù)周圍神經(jīng)損傷,新生血管網(wǎng)絡(luò)沒有本質(zhì)差別;血管生成不同階段的時相和主要調(diào)控分子有所不同。3.皮膚來源祖細胞分化的施萬細胞,作為組織工程神經(jīng)的支持細胞,有利于周圍神經(jīng)再生過程中的“血管出芽生長”和“血管重塑”。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：蘇州大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R745;R318

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