本文關(guān)鍵詞：產(chǎn)胞外多糖植物乳桿菌的分離篩選、分子表征及其應(yīng)用研究　出處：《吉林大學(xué)》2015年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：乳酸菌（Lactic acid bacteria，LAB）胞外多糖（Exopolysaccharides，EPSs）是LAB在生長代謝過程中分泌到細胞壁外的黏液多糖或莢膜多糖。LABEPS具有獨特的理化及流變學(xué)特性，可作為增稠劑、乳化劑、膠凝劑和穩(wěn)定劑廣泛應(yīng)用于發(fā)酵食品生產(chǎn)中，改善食品的流變學(xué)特性、質(zhì)構(gòu)和口感等。大量研究表明，LABEPSs還具有促進人體健康和預(yù)防疾病的生理活性，如抗腫瘤、抗氧化、抗病毒、抑制有害菌、抑制菌膜形成、免疫調(diào)節(jié)、降膽固醇以及降血壓等。此外，LABEPSs還可作為益生元促進腸道內(nèi)其他益生菌的生長，調(diào)節(jié)腸道菌群。由于LAB被公認為是安全的（GRAS）食品級微生物，因此其代謝產(chǎn)生的EPS也是安全可靠的，可直接應(yīng)用于發(fā)酵食品中。 本文對產(chǎn)EPS乳桿菌的篩選、鑒定、益生特性、EPS的分離純化、理化特性、生物活性（體外和體內(nèi)）以及產(chǎn)EPS乳桿菌在發(fā)酵乳制品中的應(yīng)用進行了系統(tǒng)研究。主要研究結(jié)果如下： 采用菌落拉絲法與EPS定量測定相結(jié)合的方法，從西藏靈菇中分離篩選到3株產(chǎn)EPS較高的乳桿菌SKT109、YW11和YW32。通過表型、生理生化、API50CH和16S rDNA方法對菌株進行了鑒定，最終判定3株菌均為植物乳桿菌（Lactobacillusplantarum）。以商業(yè)菌株鼠李糖乳桿菌GG（L.rhamnosusGG）為對照，研究了3株產(chǎn)EPS植物乳桿菌的體外益生特性。3株菌均對模擬人工胃液（pH3.0，處理3h）、低濃度膽鹽（0.3和0.6g/mL，處理3h）和低濃度過氧化氫（0.4mmol/L，處理8h）有較好的耐受性，并具有潛在的腸道表皮細胞黏附能力。菌株YW11對膽固醇、羥自由基、DPPH自由基和超氧陰離子的清除率最高，其次為菌株YW32和SKT109。 3株植物乳桿菌發(fā)酵液經(jīng)煮沸、離心、乙醇沉淀、除蛋白、透析、冷凍干燥得到粗多糖，粗多糖先后經(jīng)DEAE-Sepharose Fast Flow離子交換層析柱和Sepharose CL-6B凝膠層析柱進行分離純化。菌株SKT109合成的EPS屬于中性多糖，而菌株YW11和YW32合成的EPS均為酸性多糖或者帶酸性基團的糖復(fù)合物。采用凝膠滲透色譜（GPC）與多角度激光光散射（MALLS）聯(lián)用法測得菌株SKT109、YW11和YW32EPSs的重均分子量（Mw）分別為2.1×106Da、1.1×105Da和1.03×105Da。單糖組成分析表明，菌株SKT109EPS由果糖、葡萄糖按摩爾比為3:1組成；菌株YW11EPS由葡萄糖、半乳糖按摩爾比為2.71:1組成；菌株YW32EPS由甘露糖、果糖、半乳糖和葡萄糖按摩爾比為8.2:1.0:4.1:4.2組成。 掃描電鏡（SEM）觀察，菌株SKT109EPS呈現(xiàn)許多個立方塊緊密堆疊的微觀結(jié)構(gòu)，而菌株YW11和YW32EPSs均呈現(xiàn)高度分支的網(wǎng)絡(luò)微觀結(jié)構(gòu)。原子力顯微鏡（AFM）觀察到，3株菌的EPSs在水溶液中均形成許多不同高度的球形腫塊，表明EPSs發(fā)生了聚集現(xiàn)象。流變學(xué)特性分析表明，3株菌的EPSs在水溶液中均表現(xiàn)出假塑性（剪切稀化）。菌株YW11EPS在脫脂乳、低溫以及酸性條件下的粘度較大。熱重分析（TGA）和差示掃描量熱（DSC）分析測得菌株YW11EPS的降解溫度為287.7℃，熔點為143.6℃，表明其具有較高的熱穩(wěn)定性。 體外生物活性實驗結(jié)果表明，3株植物乳桿菌EPSs均具有一定的清除DPPH自由基、 OH、O2 的能力和螯合Fe2+的能力，同時也具有一定的總還原能力，其中菌株YW11EPS的抗氧化活性要高于菌株YW32和SKT109的EPSs，這與之前得到的菌株自身的體外抗氧化活性結(jié)果相一致。3株菌的EPSs均有不同程度的抑制4種常見致病菌（Escherichia coli O157, Shigella flexneri CMCC (B),Staphylococcus aureus AC1和Salmonella typhimurium S50333）菌膜形成的作用。當人結(jié)腸癌細胞HT-29在EPS濃度為600μg/mL下處理72h后，其生長受到明顯抑制，菌株SKT109、YW11和YW32EPSs的腫瘤抑制率達到最高，分別為45.10%、52.08%和39.24%。 通過建立人結(jié)腸癌細胞HT-29荷瘤裸鼠模型，考察L. plantarum YW11EPS的體內(nèi)抗腫瘤、抗氧化及免疫調(diào)節(jié)活性。與模型對照組相比，YW11EPS對HT-29移植瘤均有明顯的抑制作用，低、中、高劑量組的抑瘤率分別為17.16%、26.26%和36.58%，與藥物劑量呈正比。YW11EPS對荷瘤裸鼠體重、肝臟指數(shù)、腎臟指數(shù)和心臟指數(shù)均沒有顯著影響，但可顯著降低荷瘤裸鼠血清中谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）和肌酐（Cr）的水平，恢復(fù)谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）和尿素氮（BUN）至正常水平，，提高荷瘤裸鼠血液中白細胞（WBC）和淋巴細胞（LYM）的數(shù)目，同時提高荷瘤裸鼠血清中超氧化物歧化酶（SOD）活性，降低丙二醛（MDA）水平�？梢�，YW11EPS具有較好的抗腫瘤和抗氧化活性，且對機體無毒，可開發(fā)為具有潛在健康功效食品或輔助藥物用于治療結(jié)腸癌。免疫調(diào)節(jié)活性作用結(jié)果表明，YW11EPS可提高荷瘤裸鼠脾臟中自然殺傷細胞（NK）和細胞毒性淋巴細胞（CTL）的細胞毒活性，并可促進荷瘤裸鼠血清中細胞因子IL-10、IL-2和TNF-的分泌，表明L. plantarum YW11EPS主要可能是通過調(diào)節(jié)機體免疫活性來抑制腫瘤的增長。 在產(chǎn)EPS植物乳桿菌的應(yīng)用研究方面，以生物活性較好的L.plantarumYW11EPS的產(chǎn)量為指標，通過單因素分析法確定其產(chǎn)EPS的發(fā)酵條件為：SDM培養(yǎng)基，發(fā)酵時間為18h，碳源為乳糖（濃度為15g/L）、氮源為大豆蛋白胨（濃度為15g/L）、發(fā)酵溫度為32℃、接種量為3%、pH為6.0。選取對L. plantarum YW11EPS產(chǎn)量影響較為顯著的三個因素：pH、大豆蛋白胨濃度和接種量，進行響應(yīng)面分析，得到其產(chǎn)EPS的最佳發(fā)酵條件為：大豆蛋白胨濃度13.50g/L、pH6.27、接種量2.70%。在次條件下發(fā)酵L.plantarumYW11實際所得EPS產(chǎn)量為131.263mg/L，與預(yù)測值129.915mg/L基本吻合。選擇具有良好發(fā)酵性能（數(shù)據(jù)未發(fā)表）的產(chǎn)EPS L. plantarum SKT109作為輔助發(fā)酵劑，與生產(chǎn)發(fā)酵劑共同發(fā)酵生產(chǎn)發(fā)酵乳和Cheddar干酪。結(jié)果表明，L. plantarum SKT109在發(fā)酵乳中存活能力較強，可提高發(fā)酵乳的持水力和流變學(xué)特性，改善發(fā)酵乳的風味，且不會引發(fā)后酸化。L.plantarumSKT109可通過提高干酪中的水分含量、降低干酪的硬度和咀嚼性來改善干酪的質(zhì)構(gòu)。干酪成熟12周后，L.plantarumSKT109的活菌數(shù)達到7.89log cfu/g，且不會對干酪發(fā)酵劑乳酸乳球菌的生長產(chǎn)生不利影響。L. plantarumSKT109對干酪的初級蛋白水解無顯著影響，對次級蛋白水解有促進作用，干酪成熟12周后，實驗組干酪中的70%乙醇可溶性氮含量、5%磷鎢酸可溶性氮含量、pH4.6可溶性氮含量以及游離氨基酸含量均稍高于對照組干酪（P0.05）。此外，L. plantarum SKT109還可對干酪風味的形成產(chǎn)生積極影響。
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【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：TS201.3

【參考文獻】

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本文編號：1352846