本文關(guān)鍵詞：水貂腸炎病毒VP2蛋白部分氨基酸位點(diǎn)磷酸化修飾對(duì)病毒增殖的影響　出處：《中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)》2016年博士論文　論文類(lèi)型：學(xué)位論文

  更多相關(guān)文章： 水貂腸炎病毒 VP2蛋白 磷酸化 質(zhì)譜 病毒裝配

【摘要】：隱蔽期內(nèi)病毒增殖的分子生物學(xué)過(guò)程,一直是病毒學(xué)研究人員關(guān)注的熱點(diǎn)問(wèn)題,病毒感染宿主細(xì)胞的過(guò)程,實(shí)質(zhì)上是病毒蛋白質(zhì)與宿主細(xì)胞內(nèi)大分子物質(zhì)相互作用的過(guò)程。因此,研究隱蔽期內(nèi)病毒蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)及功能的變化,對(duì)闡明病毒增殖過(guò)程特別是衣殼蛋白裝配等過(guò)程至關(guān)重要。蛋白質(zhì)磷酸化修飾是研究蛋白質(zhì)間相互作用的焦點(diǎn),病毒蛋白質(zhì)的磷酸化修飾,對(duì)其與宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)或病毒自身編碼蛋白質(zhì)間相互作用具有重要的意義。水貂腸炎病毒(mink enteritis virus, MEV)是細(xì)小病毒科細(xì)小病毒屬成員,能夠感染水貂引起病毒性腸炎,給實(shí)際生產(chǎn)造成重大經(jīng)濟(jì)損失,嚴(yán)重威脅著我國(guó)乃至世界水貂養(yǎng)殖業(yè)。目前對(duì)MEV的研究主要集中于病毒病的診斷、防治及疫苗研制,而對(duì)其感染宿主細(xì)胞的分子生物學(xué)機(jī)制則研究得較少,至今還未見(jiàn)MEV病毒蛋白質(zhì)磷酸化修飾研究的報(bào)道。本課題選擇MEV為研究對(duì)象,利用本實(shí)驗(yàn)室已建立的MEV反向遺傳學(xué)操作系統(tǒng),開(kāi)展了一系列研究,獲得了如下研究結(jié)果：首先,利用電鏡觀察、滴度測(cè)定等傳統(tǒng)病毒學(xué)研究方法,結(jié)合PCR、Western blot等分子生物學(xué)方法,對(duì)MEV的形態(tài)、MEV感染F81細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線、隱蔽期等進(jìn)行了研究,結(jié)合生物信息學(xué)方法分析了MEV VP2蛋白的結(jié)構(gòu)和特性,為后續(xù)實(shí)驗(yàn)提供了理論依據(jù)和指導(dǎo)。同時(shí)還制備了兔抗MEV高免血清,并采用間接ELISA方法測(cè)定其效價(jià)為1：512000。其次,分析鑒定了MEV VP2蛋白可能的磷酸化氨基酸位點(diǎn)。使用NetPhos 2.0 Server分析VP2蛋白氨基酸序列,預(yù)測(cè)了24個(gè)可能的磷酸化位點(diǎn)；同時(shí)利用真核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)純化了VP2蛋白,使用質(zhì)譜方法檢測(cè)到了4個(gè)可能的磷酸化位點(diǎn)。兩種方法均檢測(cè)到了Ser221位點(diǎn)的磷酸化修飾。使用生物信息學(xué)軟件模擬VP2蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu),進(jìn)一步確定了需要研究的磷酸化氨基酸位點(diǎn)并制定了突變方案。按照突變方案,利用基因定點(diǎn)突變技術(shù),在己構(gòu)建的MEV感染性克隆pB-MEV中引入相應(yīng)位點(diǎn)的突變,共獲得了21個(gè)含單位點(diǎn)或多位點(diǎn)突變的MEV感染性克隆。利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染F81細(xì)胞,進(jìn)行突變體病毒的拯救及鑒定,最終共拯救獲得了7株突變體MEV。最后,結(jié)合病毒學(xué)和分子生物學(xué)方法,測(cè)定了突變體MEV病毒的滴度、生長(zhǎng)曲線及感染F81細(xì)胞后基因組復(fù)制和VP2蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果顯示,與MEV-WT相比,MEV-S221A的生長(zhǎng)曲線有較大差異,在感染后36 h,病毒滴度突然出現(xiàn)下降,隨后雖有一定的升高,但至96 h時(shí)其滴度最高值仍然較低,比MEV-WT低了兩個(gè)數(shù)量級(jí)。分子生物學(xué)方法檢測(cè)結(jié)果表明,Ser221位點(diǎn)的突變并未影響MEV-S221A的基因組復(fù)制及VP2基因的表達(dá)。本文首次對(duì)MEVVP2蛋白的磷酸化修飾進(jìn)行了分析鑒定,初步證明VP2蛋白Ser221位點(diǎn)在感染過(guò)程中能夠被磷酸化修飾,進(jìn)而影響了子代病毒衣殼裝配過(guò)程或裝配后的成熟過(guò)程,從而調(diào)控病毒的增殖。本研究不僅對(duì)探討MEV增殖過(guò)程的分子機(jī)制及致病機(jī)理具有重要價(jià)值,同時(shí)為防治MEV所引起的疾病,提供了新的理論參考和依據(jù)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：S852.65

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 陳濤;趙建軍;張海玲;吳威;錢(qián)愛(ài)東;閆喜軍;;水貂腸炎病毒B株全基因克隆與序列分析[J];吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào);2010年01期

2 趙新泰,吳祥甫,李載平,殷震;貂腸炎病毒基因的分子克隆和結(jié)構(gòu)研究[J];病毒學(xué)報(bào);1991年03期

3 馮鋒,李天憲,趙林,馬志勇,陳溥言;一株貂腸炎病毒某些特性的研究[J];微生物學(xué)報(bào);1996年06期

4 張德禮;水貂腸炎病毒疫苗效檢指標(biāo)及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型研究[J];科技通報(bào);1995年02期

5 趙新泰,殷震,趙永軍,李載平,吳祥甫;貂腸炎病毒的核苷酸序列和基因組結(jié)構(gòu)[J];遺傳學(xué)報(bào);1993年03期

6 倪佳;張蕾;柴秀麗;高晗;張海玲;趙建軍;白雪;邵西群;閆喜軍;;水貂腸炎病毒VP2基因在昆蟲(chóng)桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)中的表達(dá)[J];中國(guó)畜牧獸醫(yī);2011年09期

7 王建科;易立;許紅麗;楊莘;程悅寧;程世鵬;武華;閆喜軍;;水貂腸炎病毒LN-10分離株的分離鑒定[J];中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào);2012年06期

8 陳濤;趙建軍;張海玲;柴秀麗;閆喜軍;吳威;錢(qián)愛(ài)東;;水貂腸炎病毒VP2基因的原核表達(dá)及間接ELISA方法的建立[J];中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào);2009年09期

9 譚斌;陳微晶;武華;;致病性水貂腸炎病毒MEV-ZJ1株的分離與鑒定[J];中國(guó)畜牧獸醫(yī);2011年02期

10 侯薔;袁道莉;毛亞萍;孫佳增;王爽;李智麗;劉維全;;水貂腸炎病毒衣殼蛋白VP2的功能研究[J];畜牧與獸醫(yī);2012年S1期

相關(guān)博士學(xué)位論文 前1條

1 侯薔;水貂腸炎病毒VP2蛋白部分氨基酸位點(diǎn)磷酸化修飾對(duì)病毒增殖的影響[D];中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué);2016年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前1條

1 倪佳;表達(dá)水貂腸炎病毒VP2蛋白的重組桿狀病毒的構(gòu)建及其免疫原性分析[D];中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院;2011年

，

本文編號(hào)：1351609