本文關(guān)鍵詞：雞毒支原體生物被膜相關(guān)基因篩選及其LAMPs誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的研究　出處：《中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院》2017年博士后論文　論文類(lèi)型：學(xué)位論文

  更多相關(guān)文章： 雞毒支原體 生物被膜 隨機(jī)插入突變 LAMPs 凋亡

【摘要】：雞毒支原體(Mycoplasma Gallisepticum,MG)屬于支原體目、支原體科、支原體屬,是禽類(lèi)重要病原體之一。雞毒支原體可感染雞、鴨、鵝、鴿、鵪鶉、火雞、家雀等多種禽類(lèi),主要表現(xiàn)為呼吸道癥狀。雞群感染雞毒支原體后除表現(xiàn)咳嗽、流鼻涕、流淚、Up音、呼吸困難等癥狀外,還可導(dǎo)致蛋雞產(chǎn)蛋率下降,種蛋孵化率降低,肉雞生長(zhǎng)發(fā)育受阻,飼料轉(zhuǎn)化率降低。該病發(fā)病率極高,幾乎100%的雞場(chǎng)都有此病,雞場(chǎng)一旦感染就很難徹底清除,給養(yǎng)禽業(yè)帶來(lái)巨大的損失。很多病原菌為了適應(yīng)體內(nèi)外的環(huán)境會(huì)形成生物被膜。大量的研究表明,生物被膜的形成與病原菌的免疫逃避和抗藥性有關(guān),是影響感染的重要因素。本研究成功構(gòu)建了雞毒支原體隨機(jī)插入轉(zhuǎn)座載體,利用該載體進(jìn)行了隨機(jī)突變,建立了隨機(jī)突變庫(kù)。并利用該隨機(jī)突變庫(kù)成功篩選了12株生物被膜形成突變菌株,并成功定位了10個(gè)與之對(duì)應(yīng)的突變基因。支原體存在有一種重要的結(jié)構(gòu)脂質(zhì)相關(guān)膜蛋白(lipid associated membrane proteins,LAMPs),在支原體與宿主之間的相互作用中起重要作用。近些年,越來(lái)越多的報(bào)道指出脂蛋白在支原體毒力及致病性中占有重要作用。為探討LAMPs在雞毒支原體致病性中的作用,我們也進(jìn)行了以下研究。1.雞毒支原體隨機(jī)轉(zhuǎn)座突變庫(kù)的構(gòu)建及生物被膜相關(guān)基因的篩選為研究雞毒支原體中重要蛋白與生物被膜形成的關(guān)系。本研究擬構(gòu)建mini-Tn4001SpGm隨機(jī)轉(zhuǎn)座插入載體。該轉(zhuǎn)座子具備以下特征：含慶大霉素抗性基因,由螺原體螺旋啟動(dòng)子啟動(dòng)抗性基因的表達(dá);抗性基因兩側(cè)為含Inner和Outer的IS256插入重復(fù)區(qū)；重復(fù)區(qū)之外為金黃色葡萄球菌轉(zhuǎn)座酶基因。通過(guò)對(duì)隨機(jī)缺失株的抗性篩選和基因組PCR方法檢測(cè),成功獲得了738株隨機(jī)缺失柱。利用結(jié)晶紫染色定量法所構(gòu)建的738株突變庫(kù)中的突變株進(jìn)行生物被膜能力形成檢測(cè),共通過(guò)3輪篩選出12株生物被膜減少的突變株,其減少率在30-80%之間,又通過(guò)gene walking鑒定10個(gè)被插入阻斷的基因分別為S-adenosylmethionine synthetase、Phosphomannomutase、ABC transporter ATP-binding protein、ABC transporter permease、variable lipoprotein family protein、methionyl-tRNA synthetase、PTS system fructose-specific enzyme EIIABC、 Pyruvate dehydrogenase E1 subunit alpha、enolase和conserved hypothetical membrane protein。這10個(gè)基因按功能分括Gene regulation、Cellular processes、Translationfunction、Metabolism和Unknown function。我們鑒定出了多個(gè)影響生物膜形成的新基因,這些基因的發(fā)現(xiàn)為進(jìn)一步研究雞毒支原體生物膜形成的調(diào)控機(jī)制,研究雞毒支原體的慢性感染機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。2.雞毒支原體LAMPs誘導(dǎo)DF1細(xì)胞凋亡研究雞毒支原體存在有一種重要的結(jié)構(gòu)脂質(zhì)相關(guān)膜蛋白(LAMPs),在支原體與宿主之間的相互作用中起重要作用。越來(lái)越多的報(bào)道指出脂蛋白在支原體毒力及致病性中占有重要作用。首先建立了雞毒支原體LAMPs與雞胚成纖維細(xì)胞DF1相互作用的模型,采用MTT法檢測(cè)LAMPs對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制率,通過(guò)DAPI,TUNEL, AO-EB和Annexin-V-PI檢測(cè)確定了LAMPs具有誘導(dǎo)DFl細(xì)胞凋亡的作用。為了進(jìn)一步確定LAMPs誘導(dǎo)凋亡的調(diào)控機(jī)制和途徑信號(hào)通路,實(shí)驗(yàn)證實(shí),LAMPs可以激活DF1細(xì)胞中caspase 3的活性,裂解PARP。對(duì)其凋亡信號(hào)通路的了解,將有助于人們找到合適的藥物作用靶標(biāo),對(duì)雞毒支原體感染的疾病進(jìn)行治療。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：博士后
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類(lèi)號(hào)】：S852.62

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