本文關(guān)鍵詞：SIRT6對(duì)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞功能影響的研究　出處：《山西醫(yī)科大學(xué)》2016年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：干細(xì)胞是一類具有自我更新和多向分化潛能的原始未分化細(xì)胞,其主要作用是維持組織內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)和修復(fù)受損組織。干細(xì)胞大體可分為胚胎干細(xì)胞和成體干細(xì)胞:成體干細(xì)胞相對(duì)于胚胎干細(xì)胞由于其取材方便、來(lái)源豐富從而被廣泛認(rèn)可,尤其骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BM-MSCs)是研究和應(yīng)用最廣的成體干細(xì)胞之一。干細(xì)胞移植特別是自體干細(xì)胞移植在許多疾病(例如糖尿病、周圍血管疾病、心肌病,神經(jīng)退行性疾病以及骨關(guān)節(jié)疾病等)的研究上取得了顯著進(jìn)展。隨著研究的深入我們發(fā)現(xiàn):在老年患者中的治療效果不如年輕患者顯著。有研究報(bào)道:衰老是影響干細(xì)胞治療效果一個(gè)重要原因,隨著年齡的增長(zhǎng),體內(nèi)干細(xì)胞的數(shù)量,分化能力和增殖能力均下降。對(duì)于老年患者而言,使衰老的干細(xì)胞年輕化是改善治療效果的一個(gè)重要途徑。SIRT6是一個(gè)煙酰胺腺嘌呤而核苷酸(nicotinamideadenine dinucleotide,NAD+)依賴的組蛋白去乙�；�,通過(guò)調(diào)節(jié)染色體端粒結(jié)構(gòu)改變,沉默相關(guān)的靶基因,是基因沉默調(diào)節(jié)蛋白。Mostoslavsky等發(fā)現(xiàn)在SIRT6基因敲除小鼠中,小鼠表現(xiàn)出早衰表型,且于四周左右死亡。Kanfi,Kawahara等人則證實(shí)SIRT6可以延長(zhǎng)雄性小鼠的壽命延緩衰老。在細(xì)胞水平,SIRT6也被證實(shí)可以提高多種細(xì)胞的增殖能力,分化能力,使細(xì)胞衰老表型降低,相關(guān)的功能提高,使細(xì)胞年輕化。提示:SIRT6可能是一個(gè)抗衰老的因子。但是SIRT6對(duì)人的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(human bone marrow mesenchymal stem cells,hBM-MSCs)的作用還不清楚。本課題提出假設(shè):SIRT6對(duì)于h BM-MSCs是一個(gè)抗衰老的因子,SIRT6基因敲除后,h BM-MSCs的相關(guān)功能均受損�；谝陨霞僭O(shè)本課題研究?jī)?nèi)容如下:1.不同年齡組hBM-MSCs的培養(yǎng)和鑒定2.檢測(cè)SIRT6在不同年齡hBM-MSCs的表達(dá)3.檢測(cè)不同年齡組hBM-MSCs的相關(guān)功能。4.檢測(cè)sirt6-knockdown后hbm-mscs相關(guān)功能改變目的:1.證實(shí)sirt6在不同年齡hbm-mscs的表達(dá)有差異。2.證實(shí)不同年齡的hbm-mscs功能有差異。3.證實(shí)sirt6基因干擾后hbm-mscs的生物學(xué)功能表現(xiàn)為衰老。4.探索sirt6衰老之間的關(guān)系。方法:hbm-mscs的收集和培養(yǎng):收集不同年齡人的骨髓,幼兒組(infant)27例,1-13歲,平均年齡=5.4±0.7歲,青年組(young)38例,16-35歲,平均年齡=25.9±0.8歲,老年組(old)53例,55-81歲,平均年齡=67.9±1.0歲。在人的髂后上棘收集骨髓后,以1ml骨髓與5ml10%fbsimdm培養(yǎng)基的比例將骨髓接種入t-25培養(yǎng)瓶中,待細(xì)胞達(dá)到80-90%融合時(shí),將細(xì)胞以5000細(xì)胞/cm2的密度傳代,實(shí)驗(yàn)中所用的細(xì)胞均為第四代細(xì)胞。hbm-mscs的鑒定:用干細(xì)胞表面標(biāo)記染色和成脂、成骨分化兩種方法來(lái)證明所培養(yǎng)的細(xì)胞為hbm-mscs。常規(guī)胰酶消化收集細(xì)胞后,制成濃度為106細(xì)胞/ml的單細(xì)胞懸液,取100μl懸液分別加入干細(xì)胞表變標(biāo)記抗體cd105-fitc、cd34-pe、cd45-pc5和cd44-pe,室溫避光孵育20min,用流式細(xì)胞儀檢測(cè)培養(yǎng)細(xì)胞的cd105、cd34、cd45和cd44的細(xì)胞陽(yáng)性率。按照說(shuō)明書將培養(yǎng)的細(xì)胞分別用人的成骨、成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)基誘導(dǎo)分化,誘導(dǎo)分化完成后分別用茜素紅和油紅“o”染色。sirt6和p16在hbm-mscs中mrna水平和蛋白水平的表達(dá):分別用reversetranscription(rt)-pcr和real-timepcr檢測(cè)sirt6和p16在hbm-mscs中mrna水平的表達(dá),sirt6:前引物5’-gtcttccagtgtggtgttcca-3’,后引物5’-cccagtctaggatggtgtcc-3’;p16:前引物5’-ctcaccatggatgatgatatcgc-3’,后引物5’-aggaatccttctgacccatgc-3’;β-actin(actb):前引物5’-cctgaagtaccccatcgagc-3’,后引物reverse:5’-ctcttgctcgaagtccaggg-3’。rt-pcr產(chǎn)物條帶用imagej軟件計(jì)算,sirt6的相對(duì)mrna水平用sirt6/actb來(lái)表示(n=4/組)。sirt6的蛋白水平用westernblotting檢測(cè)(sirt6抗體:1:250,abcam;actb抗體:1:2000,abcam),蛋白密度條帶用imagej軟件計(jì)算,sirt6相對(duì)蛋白水平用sirt6/actb來(lái)表示。p16的蛋白水平用細(xì)胞免疫熒光(immunocytoflurescence,icf)來(lái)檢測(cè)。細(xì)胞用4%多聚甲醛固定后大鼠抗-p16抗體(1:100,santacruz)4℃濕盒孵育過(guò)夜,cy3-二抗(1:200)室溫避光孵育1h,dapi染核37℃避光孵育10min。檢測(cè)p16陽(yáng)性細(xì)胞率=同一視野內(nèi)紅色陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)/同一視野內(nèi)總細(xì)胞數(shù)(n=4/組)。sirt6在hbm-mscs中的定位:用icf來(lái)檢測(cè)sirt6在hbm-mscs中的定位,細(xì)胞用4%的多聚甲醛固定后兔抗-sirt6抗體(1:200,abcam)4℃濕盒孵育過(guò)夜,fitc-二抗(1:200,北京博奧森公司)37℃避光孵育1h,dapi染核37℃避光孵育10min,用倒置熒光顯微鏡拍照并觀察sirt6陽(yáng)性細(xì)胞。細(xì)胞增殖能力檢測(cè):分別用brdu摻入法和細(xì)胞生長(zhǎng)曲線計(jì)數(shù)法檢測(cè)hbm-mscs的增殖能力。brdu摻入法:將細(xì)胞接種到24孔板中,待細(xì)胞融合達(dá)到40-50%時(shí)培養(yǎng)基更換為brdu培養(yǎng)基(10%fbsimdm包含3μg/mlbrdu),培養(yǎng)3天后brdu染色。用imagej軟件計(jì)數(shù)brdu陽(yáng)性細(xì)胞,計(jì)算brdu陽(yáng)性細(xì)胞率。細(xì)胞生長(zhǎng)曲線計(jì)數(shù)法:將細(xì)胞以7000細(xì)胞/孔的密度接種到12孔板中(每例細(xì)胞3個(gè)復(fù)孔),從第0天到第6天每隔1天計(jì)數(shù)一次細(xì)胞繪制生長(zhǎng)曲線。細(xì)胞遷移能力檢測(cè):用劃痕試驗(yàn)檢測(cè)hbm-mscs的遷移能力,將細(xì)胞接種到6孔板中,待細(xì)胞達(dá)到100%融合時(shí),用20μl的移液槍尖在孔的中央垂直劃痕。用倒置顯微鏡分別在劃痕后0h和24h拍照(日本olympus),用imagej軟件計(jì)算細(xì)胞遷移率(n=4/組)。細(xì)胞死亡和凋亡檢測(cè):將hbm-mscs用h2o2(1000μm)處理6h后收集細(xì)胞,用annexin-v和pi染色(lifetechnologies)后,用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡。死亡細(xì)胞為pi陽(yáng)性annexin-v陰性細(xì)胞,凋亡細(xì)胞為annexin-v陽(yáng)性細(xì)胞(n=4/組)。sa-β-gal活性的檢測(cè):按照產(chǎn)品說(shuō)明書用衰老檢測(cè)試劑盒(中國(guó),solaribio)檢測(cè)sa-β-gal的活性。陽(yáng)性細(xì)胞率=同一視野中藍(lán)色細(xì)胞/總細(xì)胞數(shù)(n=4/組)。hbm-mscs中sirt6的基因干擾:按照產(chǎn)品說(shuō)明書用一種sirna對(duì)hbm-mscs進(jìn)行sirt6的基因干擾。將細(xì)胞以7000細(xì)胞/孔的密度用無(wú)血清無(wú)抗生素的imdm培養(yǎng)基接種到24孔板中,24h后加入3μlsirna-fam和2μllipofectamin2000(美國(guó),invitrogen),轉(zhuǎn)染6h后更換培養(yǎng)基,在熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染是否成功,轉(zhuǎn)染效率用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)fcm。sirt6的沉默效率用rt-pcr(轉(zhuǎn)染后24h)和westernblotting(轉(zhuǎn)染后72h)(n=4/組)。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析:數(shù)據(jù)用mean±sd表示,數(shù)據(jù)分析用graphpadprism5,兩組之間差異用t-test檢驗(yàn),3組使用one-或者anova檢驗(yàn),p0.05具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果:hbm-mscs的鑒定:用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)hbm-mscs的細(xì)胞表面標(biāo)記,我們發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)的細(xì)胞cd105和cd44陽(yáng)性細(xì)胞率均超過(guò)99%,并且三個(gè)年齡組之間沒(méi)有顯著差異。而cd34和cd45的陽(yáng)性細(xì)胞率均低于1%,三個(gè)年齡組之間沒(méi)有顯著差異。培養(yǎng)的細(xì)胞成骨、成脂分化后分別有大量的茜素紅陽(yáng)性細(xì)胞和油紅“o”陽(yáng)性細(xì)胞。這些結(jié)果證明本實(shí)驗(yàn)所培養(yǎng)的細(xì)胞以及后續(xù)實(shí)驗(yàn)所用的細(xì)胞具有間充質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)記且有成骨、成脂分化能力,具備hbm-mscs的特點(diǎn)。sirt6隨著年齡的增加表達(dá)增加:sirt6是一個(gè)主要在細(xì)胞核中表達(dá)的蛋白,老年組(old)的sirt6無(wú)論在mrna水平還是蛋白水平均高于幼兒組(infant)和青年組(young)(p0.01)。sirna轉(zhuǎn)染使sirt6表達(dá)下降:轉(zhuǎn)染后6h用熒光顯微鏡觀察fam檢測(cè)hbm-mscs中sirna轉(zhuǎn)染陽(yáng)性率。未轉(zhuǎn)染(空白對(duì)照組,control)的細(xì)胞呈fam陰性,但是陰性對(duì)照組(nc)和干擾組(sirna)呈fam陽(yáng)性,但是老年組(old)的fam陽(yáng)性細(xì)胞率低于青年組(young)(p0.01)。sirna有效降低了sirt6的表達(dá):無(wú)論在mrna水平還是蛋白水平,老年細(xì)胞和青年細(xì)胞的干擾組(sirna)sirt6的表達(dá)均低于各自的陰性對(duì)照組(nc)(p0.01)。sirt6沉默后hbm-mscs增殖能力降低:三個(gè)年齡組的hbm-mscs均有brdu陽(yáng)性細(xì)胞,其中幼兒組(infant)和青年組(young)的陽(yáng)性細(xì)胞率高于老年組(old)的2倍(p0.01)。生長(zhǎng)曲線也發(fā)現(xiàn)幼兒組(infant)和青年組(young)細(xì)胞的生長(zhǎng)速度高于老年組(old)(p0.01)。這些提示:hbm-mscs的增殖能力隨著年齡的增長(zhǎng)呈下降趨勢(shì)。sirt6sirna轉(zhuǎn)染后,青年組和老年組的sirt6表達(dá)水平均降低。青年細(xì)胞和老年細(xì)胞sirna組的生長(zhǎng)速度均低于各自的nc組(p0.01)。我們還發(fā)現(xiàn)老年sirna組的細(xì)胞幾乎沒(méi)有增殖能力。這些提示:sirt6可能在細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖能力發(fā)揮重要的作用。sirt6沉默后hbm-mscs遷移功能受損:劃痕實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)老年組細(xì)胞遷移率明顯低于幼兒組和青年組。幼兒組和青年組的遷移率高于老年組的3倍(p0.01)。sirt6沉默后青年組和老年組hbm-mscs遷移能力均下降(p0.05)。這些提示:隨著年齡的增長(zhǎng)hbm-mscs的遷移能力下降,sirt6參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的遷移能力。sirt6對(duì)hbm-mscs抗凋亡能力和氧化應(yīng)激耐受能力的影響:hbm-mscsannexin-v和pi染色后用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)凋亡水平。我們發(fā)現(xiàn)老年組細(xì)胞的凋亡細(xì)胞率高于幼兒組和青年組的8倍(p0.05)。老年組的死亡細(xì)胞率也高于幼兒組和青年組,但是沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。為了證明sirt6的抗凋亡能力,用sirna轉(zhuǎn)染將sirt6沉默,我們發(fā)現(xiàn)細(xì)胞的凋亡細(xì)胞率和死亡細(xì)胞率均為發(fā)生顯著改變。這些提示:隨著年齡的增長(zhǎng)hbm-mscs的抗凋亡能力降低,但是sirt6沉默后并未影響細(xì)胞的抗凋亡能力。為了證明年齡對(duì)細(xì)胞氧化應(yīng)激耐受能力的影響,先將不同年齡組的hbm-mscsh2o2處理6h,再用annexin-v和pi染色細(xì)胞后流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞的存活率。我們發(fā)現(xiàn)老年組死亡細(xì)胞率明顯高于幼兒組和青年組(p0.05),凋亡細(xì)胞率高于幼兒組和青年組的8倍(p0.01)。為了證明sirt6對(duì)細(xì)胞氧化應(yīng)激耐受能力的影響,青年組的細(xì)胞用sirt6-sirna或者nc-sirna轉(zhuǎn)染后h2o2處理6h,sirna組的死亡細(xì)胞率高于nc組的2倍。(p0.05),但是兩組細(xì)胞的凋亡細(xì)胞率沒(méi)有顯著差異。這些提示:年齡增加了細(xì)胞對(duì)氧化應(yīng)激的敏感性,但是sirt6的水平?jīng)]有改變細(xì)胞的敏感性。SIRT6沉默后h BM-MSCs SA-β-Gal活性增加:SA-β-Gal活性是細(xì)胞衰老的一個(gè)特性,老年組的SA-β-Gal陽(yáng)性細(xì)胞高于幼兒組和青年組的16倍(P0.01),青年組的細(xì)胞SIRT6沉默后,siRNA組的SA-β-Gal陽(yáng)性細(xì)胞率高于NC組的2倍(P0.05)。這些提示:年齡促進(jìn)細(xì)胞的衰老而SIRT6延緩細(xì)胞的衰老。SIRT6沉默后p16表達(dá)增加:p16的表達(dá)是細(xì)胞衰老的一個(gè)重要參數(shù),在mRNA水平,老年組hBM-MSCs的水平高于幼兒組和青年組的2倍(P0.01),SIRT6沉默后,青年hBM-MSCs siRNA組的水平高于NC組的2倍(P0.05)。同樣,老年hBM-MSCs p16陽(yáng)性細(xì)胞率高于幼兒組和青年組(P0.01),SIRT6沉默后青年hBM-MSCs si RNA組的p16陽(yáng)性細(xì)胞率明顯高于NC組。再次證明:年齡促進(jìn)細(xì)胞的衰老而SIRT6延緩細(xì)胞的衰老。結(jié)論:1.SIRT6是一個(gè)主要在細(xì)胞核中表達(dá)的蛋白,隨著年齡的增長(zhǎng)其在hBM-MSCs的表達(dá)增加。2.隨著年齡的增長(zhǎng),hBM-MSCs的增殖能力、遷移能力、抗凋亡能力以及氧化應(yīng)激耐受能力均下降,SA-β-Gal活性提高,p16的表達(dá)增加。3.SIRT6沉默后,hBM-MSCs的增殖能力、遷移能力和氧化應(yīng)激耐受能力均下降,SA-β-Gal活性提高,p16的表達(dá)增加。4.年齡促進(jìn)hBM-MSCs的衰老而SIRT6延緩細(xì)胞的衰老。
【學(xué)位授予單位】：山西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R329.2

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本文編號(hào)：1334446