發(fā)布時間：2017-12-25 16:11

  本文關(guān)鍵詞：基于SERS的細(xì)胞活性分析　出處：《吉林大學(xué)》2017年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：本論文將表面增強(qiáng)拉曼散射(surface enhanced Raman scattering,SERS)光譜檢測技術(shù)引入到細(xì)胞和組織分析中,將四唑鹽還原法及抗體標(biāo)記分析法與SERS相結(jié)合,通過改進(jìn)、優(yōu)化實驗條件,建立了基于SERS的細(xì)胞活性和免疫細(xì)胞化學(xué)分析技術(shù)。這些方法的建立大大提高了分析檢測效率以及檢測靈敏度,同時簡化了實驗步驟,縮短了檢測時間,在細(xì)胞生物學(xué)和組織化學(xué)研究領(lǐng)域具有很大的應(yīng)用潛力。本文的主要創(chuàng)新成果如下:1.在3-(4,5-二甲基-2-噻唑基)-2,5-二苯基-2H-四氮唑溴鹽(MTT)比色分析法檢測細(xì)胞活性的基礎(chǔ)上,利用SERS技術(shù)作為檢測手段,通過檢測MTT分子以及經(jīng)過活細(xì)胞中脫氫酶催化后生成的還原產(chǎn)物甲佨(Formazan)分子SERS光譜的變化,完成細(xì)胞活性的分析檢測。結(jié)果表明,反應(yīng)產(chǎn)物Formazan分子SERS光譜的強(qiáng)度與活細(xì)胞數(shù)目呈現(xiàn)良好的正相關(guān)性。該方法的建立使檢測時間從4小時縮短到30分鐘以內(nèi);檢測靈敏度提高了1000倍,達(dá)到0.1 ng/m L;為細(xì)胞活性分析提供了一種更加有效、超靈敏的檢測手段。2.以水溶性的2-(2-甲氧基-4-硝苯基)-3-(4-硝苯基)-5-(2,4-二磺基苯)-2H-四唑單鈉鹽代替MTT分子,結(jié)合SERS檢測技術(shù)改進(jìn)了上述細(xì)胞活性分析方法。以SERS作為檢測手段,不僅將檢測時間縮短至30分鐘;而且將檢測靈敏度提高到0.1μM;進(jìn)一步通過人MDA-MB231乳癌細(xì)胞的活性分析表明,SERS技術(shù)的超靈敏性可使細(xì)胞活性的檢測由比色分析法中105個減少至50個細(xì)胞的檢測。該方法的建立,集成了基于SERS技術(shù)的MTT細(xì)胞活性分析方法的全部優(yōu)勢,且避免了MTT分析法需加入有機(jī)溶劑二甲基亞砜對檢測的干擾及對細(xì)胞所產(chǎn)生的毒性殺傷,使之更利于懸浮及貼壁細(xì)胞功能活性的長期活體、實時監(jiān)測。3.制備了免疫膠體金檢測探針,建立了基于SERS的大鼠腦皮質(zhì)神經(jīng)元細(xì)胞的免疫識別檢測方法。將所制備的免疫膠體金探針分別引入大鼠腦皮質(zhì)神經(jīng)元細(xì)胞及大鼠腦皮質(zhì)組織切片中,免疫識別作用之后,通過SERS手段采集拉曼標(biāo)記分子的信號,以此實現(xiàn)對神經(jīng)元細(xì)胞的定位識別以及細(xì)胞所表達(dá)的生物分子的定量分析。與原有的免疫細(xì)胞化學(xué)方法相比,該方法的優(yōu)越性體現(xiàn)在:SERS技術(shù)的引入大大提高了檢測靈敏度,我們發(fā)現(xiàn)當(dāng)抗體濃度為6.25×10-5 mg/m L時雖早已無法使細(xì)胞顯色但依然可以檢測到細(xì)胞中相關(guān)生物分子的SERS信號;將SERS活性探針直接標(biāo)記于一抗上,不需要加入二抗等其它抗體,簡化了實驗步驟;SERS探針分子與組織及細(xì)胞體系中的生物分子無特異性吸附,避免了假陽性檢測結(jié)果;用探針分子的SERS光譜代替顯微鏡下的肉眼主觀觀察,實現(xiàn)了對待測細(xì)胞及相關(guān)目標(biāo)生物分子的量化分析,使結(jié)果更為客觀。4.制備了金銀復(fù)合殼空心球納米結(jié)構(gòu),并通過拉曼探針標(biāo)記以及抗體修飾制備了具有生物活性的免疫SERS探針,實現(xiàn)了對人免疫球蛋白(Ig G)以及大鼠胰島組織中胰島素的檢測分析。制備了SERS活性較高的金銀復(fù)合殼空心球納米粒子,其增強(qiáng)能力與銀、金納米粒子相比分別提高了5和20倍。將Ig G抗體修飾和4-巰基苯甲酸分子標(biāo)記的金銀復(fù)合殼空心球納米粒子用于Ig G的定量分析,該方法操作簡便,靈敏度高。此外,將3,3'-二乙基硫醛三碳菁化碘標(biāo)記于抗體修飾的金銀復(fù)合殼空心球納米粒子,引入到了大鼠胰島組織切片中,實現(xiàn)了SERS在復(fù)雜的生物組織中對胰島β細(xì)胞及胰島素分子的微量檢測。
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：Q-33;O657.37

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9 楊U，

本文編號：1333516