本文關(guān)鍵詞：植物蛋白激酶CIPK和CK1A的生物學(xué)功能及生化分析　出處：《湖南大學(xué)》2016年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：蛋白激酶催化的靶蛋白磷酸化修飾是植物體內(nèi)調(diào)節(jié)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的重要機制。已有大量的研究表明,蛋白磷酸化參與了植物的生長發(fā)育、植物的抗逆性以及各種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路等一系列生命過程。CIPK和CK1是植物中研究得較為廣泛的兩個蛋白激酶亞家族,其中CIPK在CBL-CIPK系統(tǒng)介導(dǎo)的植物對逆境應(yīng)答過程中發(fā)揮了重要作用。CK1在調(diào)控植物開花時間,根的發(fā)育、微管調(diào)控等方面有重要作用。結(jié)合本實驗室和合作單位的前期工作基礎(chǔ),本文對植物CIPK和CK1進行了系統(tǒng)的生物信息學(xué)分析,利用實時熒光定量PCR分析了基因表達模式,利用過表達和缺失功能突變體對CIPK和CK1在脅迫信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與生長發(fā)育調(diào)控中的功能進行了系統(tǒng)研究,獲得了如下主要研究結(jié)果:(1)利用生物信息學(xué)方法分析了高粱CIPKs編碼基因的核酸和氨基酸序列�；蚪Y(jié)構(gòu)分析表明SbCIPKs可分為含內(nèi)含子和不含內(nèi)含子兩個亞族,在聚類分析中也分布于兩個獨立的分支�；蚪M進化分析表明在含內(nèi)含子和不含內(nèi)含子分支中均發(fā)現(xiàn)有片段倍增現(xiàn)象,而串聯(lián)倍增則只出現(xiàn)在不含內(nèi)含子亞族。SbCIPK的蛋白信息分析表明SbCIPK含有兩個保守的功能結(jié)構(gòu)域:N端的蛋白激酶結(jié)構(gòu)域和C端的NAF結(jié)構(gòu)域。激酶區(qū)為催化結(jié)構(gòu)域,序列高度保守;NAF結(jié)構(gòu)域為CBL相互作用所需結(jié)構(gòu)域,保守程度相對較低。plant CARE分析表明大部分SbCIPK的啟動子區(qū)都含有多個脅迫信號響應(yīng)元件,而RT-PCR結(jié)果也表明,SbCIPK的表達水平也受到堿脅迫信號的誘導(dǎo),表明SbCIPKs可能在抗鹽脅迫中發(fā)揮作用。(2)本實驗室前期報道了At CIPK14在擬南芥鹽脅迫應(yīng)答中的功能,本文選取了其同源蛋白SbCIPK4進行了初步的功能研究。SbCIPK4過表達植株在鹽脅迫條件下的表型數(shù)據(jù)表明,在鹽脅迫條件下野生型的幼根的生長及幼苗半徑相較于過表達植株都受到了更顯著的抑制,同時,脅迫信號通路的關(guān)鍵基因的RT-PCR結(jié)果也顯示SbCIPK4過量表達轉(zhuǎn)基因植株中脅迫反應(yīng)相關(guān)基因的表達受鹽誘導(dǎo)的程度大,說明鹽脅迫條件下SbCIPK4可能通過促進脅迫相關(guān)基因的表達提高植物的耐鹽脅迫能力。35S::GFP:SbCIPK4的瞬時表達與亞細胞定位結(jié)果均表明SbCIPK4定位于核內(nèi),是一個核蛋白激酶。(3)酵母雙雜交篩選結(jié)果表明,SbCIPK4與SbCBL5互作,且發(fā)現(xiàn)SbCBL5通過N端結(jié)構(gòu)域與其相互作用。Pull-down分析也驗證了SbCIPK4與SbCBL5在體外存在相互作用。鹽脅迫條件下,SbCBLs與SBCIPKs的協(xié)同表達分析表明,兩者均受到Na2CO3誘導(dǎo)表達,且SbCIPK4與SbCBL5基因表達量同時顯著增強。(4)生物信息學(xué)分析結(jié)果表明:CK1A基因的調(diào)控區(qū)域存在大量與光調(diào)控相關(guān)和脅迫誘導(dǎo)相關(guān)的元件。生物芯片和Q-PCR分析表明CK1A在植物生長發(fā)育的多個階段都有較高表達,特別是在植物器官花和種子的發(fā)育和成熟過程中表達最高。CK1A RNAi植株在長日照條件下表現(xiàn)出晚花表型,并且開花基因FT、SOC1、和CO都有一定程度的降低,特別是成花素基因FT的表達下調(diào)最為明顯。成功建立了CK1A激酶結(jié)構(gòu)域的原核表達和純化體系,得到了純度較高的CK1A重組蛋白,對重組蛋白的激酶自磷酸化實驗證明其具有體外自磷酸化激酶活性。綜上,本研究運用多種生物信息學(xué)工具和分子生物學(xué)方法探討和闡明了CIPK基因在植物抗鹽脅迫中的生理功能及分子機制,以及CK1A基因在植物開花光周期途徑中的生物學(xué)功能。
【學(xué)位授予單位】：湖南大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：Q946

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1 郭明;植物蛋白激酶CIPK和CK1A的生物學(xué)功能及生化分析[D];湖南大學(xué);2016年

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本文編號：1333313