本文關(guān)鍵詞：植物蛋白激酶CIPK和CK1A的生物學(xué)功能及生化分析　出處：《湖南大學(xué)》2016年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：蛋白激酶催化的靶蛋白磷酸化修飾是植物體內(nèi)調(diào)節(jié)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的重要機(jī)制。已有大量的研究表明,蛋白磷酸化參與了植物的生長發(fā)育、植物的抗逆性以及各種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路等一系列生命過程。CIPK和CK1是植物中研究得較為廣泛的兩個(gè)蛋白激酶亞家族,其中CIPK在CBL-CIPK系統(tǒng)介導(dǎo)的植物對(duì)逆境應(yīng)答過程中發(fā)揮了重要作用。CK1在調(diào)控植物開花時(shí)間,根的發(fā)育、微管調(diào)控等方面有重要作用。結(jié)合本實(shí)驗(yàn)室和合作單位的前期工作基礎(chǔ),本文對(duì)植物CIPK和CK1進(jìn)行了系統(tǒng)的生物信息學(xué)分析,利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析了基因表達(dá)模式,利用過表達(dá)和缺失功能突變體對(duì)CIPK和CK1在脅迫信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與生長發(fā)育調(diào)控中的功能進(jìn)行了系統(tǒng)研究,獲得了如下主要研究結(jié)果:(1)利用生物信息學(xué)方法分析了高粱CIPKs編碼基因的核酸和氨基酸序列�；蚪Y(jié)構(gòu)分析表明SbCIPKs可分為含內(nèi)含子和不含內(nèi)含子兩個(gè)亞族,在聚類分析中也分布于兩個(gè)獨(dú)立的分支。基因組進(jìn)化分析表明在含內(nèi)含子和不含內(nèi)含子分支中均發(fā)現(xiàn)有片段倍增現(xiàn)象,而串聯(lián)倍增則只出現(xiàn)在不含內(nèi)含子亞族。SbCIPK的蛋白信息分析表明SbCIPK含有兩個(gè)保守的功能結(jié)構(gòu)域:N端的蛋白激酶結(jié)構(gòu)域和C端的NAF結(jié)構(gòu)域。激酶區(qū)為催化結(jié)構(gòu)域,序列高度保守;NAF結(jié)構(gòu)域?yàn)镃BL相互作用所需結(jié)構(gòu)域,保守程度相對(duì)較低。plant CARE分析表明大部分SbCIPK的啟動(dòng)子區(qū)都含有多個(gè)脅迫信號(hào)響應(yīng)元件,而RT-PCR結(jié)果也表明,SbCIPK的表達(dá)水平也受到堿脅迫信號(hào)的誘導(dǎo),表明SbCIPKs可能在抗鹽脅迫中發(fā)揮作用。(2)本實(shí)驗(yàn)室前期報(bào)道了At CIPK14在擬南芥鹽脅迫應(yīng)答中的功能,本文選取了其同源蛋白SbCIPK4進(jìn)行了初步的功能研究。SbCIPK4過表達(dá)植株在鹽脅迫條件下的表型數(shù)據(jù)表明,在鹽脅迫條件下野生型的幼根的生長及幼苗半徑相較于過表達(dá)植株都受到了更顯著的抑制,同時(shí),脅迫信號(hào)通路的關(guān)鍵基因的RT-PCR結(jié)果也顯示SbCIPK4過量表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株中脅迫反應(yīng)相關(guān)基因的表達(dá)受鹽誘導(dǎo)的程度大,說明鹽脅迫條件下SbCIPK4可能通過促進(jìn)脅迫相關(guān)基因的表達(dá)提高植物的耐鹽脅迫能力。35S::GFP:SbCIPK4的瞬時(shí)表達(dá)與亞細(xì)胞定位結(jié)果均表明SbCIPK4定位于核內(nèi),是一個(gè)核蛋白激酶。(3)酵母雙雜交篩選結(jié)果表明,SbCIPK4與SbCBL5互作,且發(fā)現(xiàn)SbCBL5通過N端結(jié)構(gòu)域與其相互作用。Pull-down分析也驗(yàn)證了SbCIPK4與SbCBL5在體外存在相互作用。鹽脅迫條件下,SbCBLs與SBCIPKs的協(xié)同表達(dá)分析表明,兩者均受到Na2CO3誘導(dǎo)表達(dá),且SbCIPK4與SbCBL5基因表達(dá)量同時(shí)顯著增強(qiáng)。(4)生物信息學(xué)分析結(jié)果表明:CK1A基因的調(diào)控區(qū)域存在大量與光調(diào)控相關(guān)和脅迫誘導(dǎo)相關(guān)的元件。生物芯片和Q-PCR分析表明CK1A在植物生長發(fā)育的多個(gè)階段都有較高表達(dá),特別是在植物器官花和種子的發(fā)育和成熟過程中表達(dá)最高。CK1A RNAi植株在長日照條件下表現(xiàn)出晚花表型,并且開花基因FT、SOC1、和CO都有一定程度的降低,特別是成花素基因FT的表達(dá)下調(diào)最為明顯。成功建立了CK1A激酶結(jié)構(gòu)域的原核表達(dá)和純化體系,得到了純度較高的CK1A重組蛋白,對(duì)重組蛋白的激酶自磷酸化實(shí)驗(yàn)證明其具有體外自磷酸化激酶活性。綜上,本研究運(yùn)用多種生物信息學(xué)工具和分子生物學(xué)方法探討和闡明了CIPK基因在植物抗鹽脅迫中的生理功能及分子機(jī)制,以及CK1A基因在植物開花光周期途徑中的生物學(xué)功能。
【學(xué)位授予單位】：湖南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：Q946

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1 郭明;植物蛋白激酶CIPK和CK1A的生物學(xué)功能及生化分析[D];湖南大學(xué);2016年

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本文編號(hào)：1333313