本文關(guān)鍵詞：骨髓與心臟來(lái)源的間質(zhì)干細(xì)胞對(duì)組織損傷修復(fù)的作用及機(jī)制初探　出處：《中山大學(xué)》2016年博士論文　論文類(lèi)型：學(xué)位論文

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【摘要】：間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells,MSCs)最初是從骨髓中分離得到的非造血類(lèi)的干細(xì)胞,它參與構(gòu)成骨髓造血微環(huán)境,對(duì)造血干細(xì)胞的增殖與分化具有明顯的支持作用。MSCs具有自我更新和多向分化潛能,體外可分化為成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、軟骨細(xì)胞等。傳統(tǒng)上一直認(rèn)為,干細(xì)胞是通過(guò)分化為特定細(xì)胞來(lái)替代病損的組織器官,間充質(zhì)干細(xì)胞具有直接分化為成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞的能力,可以通過(guò)直接替代損傷細(xì)胞從而在大段骨缺損或軟骨損傷的修復(fù)中發(fā)揮作用。隨后的研究發(fā)現(xiàn),MSCs具有營(yíng)養(yǎng)支持與免疫調(diào)節(jié)功能,可能在組織損傷修復(fù)與疾病治療中扮演了更加重要的角色。例如,MSCs通過(guò)旁分泌營(yíng)養(yǎng)介質(zhì)(trophic mediators)可以抑制缺血導(dǎo)致的凋亡、抑制瘢痕形成、刺激血管新生和維持血管穩(wěn)定性、刺激組織內(nèi)源性干細(xì)胞分裂。在MSCs的免疫調(diào)節(jié)方面,MSCs能抑制T細(xì)胞由絲裂原刺激的增殖反應(yīng),增加調(diào)節(jié)性T細(xì)胞比例,降低Th1/Th2比例,進(jìn)而引起Th17數(shù)量下降;MSCs可以抑制B細(xì)胞的增殖、活化以及其抗體分泌,影響B(tài)細(xì)胞的趨化功能;MSCs抑制NK細(xì)胞增殖、細(xì)胞毒作用和細(xì)胞因子的分泌;MSCs還影響抗原提呈細(xì)胞(APC)的抗原遞呈功能,通過(guò)下調(diào)APC表面的MHC分子以及共刺激分子(CD40、CD86、CD80)和抑制DC細(xì)胞成熟來(lái)抑制T細(xì)胞的活化。參與MSCs免疫調(diào)節(jié)作用的主要分子包括轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(TGFβ)、前列腺素E2(PGE-2)、腫瘤壞死因子誘導(dǎo)蛋白6(TSG6)、一氧化氮(NO)、吲哚胺-2,3-雙加氧酶(IDO)等。但抑制上述分子的表達(dá)并不能完全逆轉(zhuǎn)MSC的免疫調(diào)節(jié)功能,提示可能存在未知的調(diào)節(jié)分子或調(diào)控途徑參與其中。因此,尋找和發(fā)現(xiàn)參與MSCs免疫調(diào)節(jié)作用的新分子與新途徑對(duì)于系統(tǒng)闡述MSCs參與損傷修復(fù)的機(jī)制,推動(dòng)其臨床轉(zhuǎn)化應(yīng)用具有重要意義。課題組前期的表達(dá)譜測(cè)序結(jié)果發(fā)現(xiàn),胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白7(insulin-like growth factor bingding protein 7,IGFBP7)基因在免疫調(diào)節(jié)功能最強(qiáng)的小鼠MSCs亞群中表達(dá)最高,提示IGFBP7可能參與小鼠MSCs的免疫調(diào)節(jié)功能。但其具體參與MSCs的免疫調(diào)節(jié)機(jī)制是值得探討的科學(xué)問(wèn)題。近年來(lái)研究顯示,除骨髓外,在脂肪、臍帶、腎臟、心臟等多種臟器或組織中均有MSCs的存在,并表現(xiàn)出類(lèi)似的修復(fù)病損組織的功能。本課題組利用Nestin-GFP轉(zhuǎn)基因小鼠研究顯示,新生小鼠Nestin除了在中樞和外周神經(jīng)系統(tǒng)表達(dá)外,還廣泛分布在骨髓、胰腺、睪丸、腎臟、視網(wǎng)膜、心臟等多個(gè)組織;從睪丸、腎臟等組織分選得到的GFP陽(yáng)性細(xì)胞具有自我更新和間質(zhì)分化能力,證明Nestin是成體組織間質(zhì)干細(xì)胞的特異標(biāo)志,為進(jìn)一步獲得適合損傷修復(fù)的間質(zhì)干細(xì)胞亞群提供了重要依據(jù)。進(jìn)一步從Nestin-GFP小鼠心臟中分離了Nestin+細(xì)胞具有間質(zhì)干細(xì)胞特性,并在修復(fù)損傷心肌組織中表現(xiàn)出優(yōu)于骨髓MSCs的治療作用。因此,不同組織來(lái)源的MSCs在修復(fù)其對(duì)應(yīng)的靶組織的損傷上是否具有更好的作用?其治療損傷修復(fù)的作用機(jī)制如何?有待于深入闡明。因此,本研究?jī)?nèi)容分為以下2個(gè)部分:第一部分:胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白7(IGFBP7)在小鼠MSCs免疫調(diào)節(jié)中的作用機(jī)制研究第二部分:心臟來(lái)源的Nestin+MSCs治療小鼠急性心肌梗死模型中的作用機(jī)制初探第一部分胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白7(IGFBP7)在小鼠MSCs免疫調(diào)節(jié)中的作用機(jī)制研究1.目的目前已知MSCs的免疫調(diào)節(jié)可能途徑有NO、IDO、PGE2、IL-10、TSG6、Galectin1和TGFβ等,除上述分子外,是否還有其它分子參與MSC的免疫調(diào)節(jié)機(jī)制是值得探究的關(guān)鍵科學(xué)問(wèn)題。已有研究顯示IFN-gamma受體突變的人MSCs仍有免疫調(diào)節(jié)功能,并提示IGFBPs可能參與免疫調(diào)節(jié),但其調(diào)節(jié)機(jī)制遠(yuǎn)未闡明;課題組利用表達(dá)譜測(cè)序發(fā)現(xiàn)在免疫調(diào)節(jié)能力最強(qiáng)的小鼠MSCs亞群中IGFBP7表達(dá)水平最高,提示其可能參與了小鼠MSCs的免疫調(diào)節(jié)功能,據(jù)此,本部分研究擬系統(tǒng)揭示IGFBP7參與MSCs的免疫調(diào)節(jié)功能的作用機(jī)制。2.方法2.1利用Q-PCR檢測(cè)IGFBPs家族成員(IGFBP1-7)在小鼠骨髓MSCs中的表達(dá)水平。2.2利用RNA干擾的方法構(gòu)建IGFBP7分子表達(dá)穩(wěn)定下調(diào)的MSCs細(xì)胞株。并利用Q-PCR和Western blot在m RNA水平和蛋白水平檢測(cè)IGFBP7的干擾效率。2.3在體外實(shí)驗(yàn)中比較對(duì)照組和干擾組的MSCs細(xì)胞的增殖情況、表面標(biāo)志物的表達(dá)和三向分化(成骨,成脂和成軟骨)的情況。2.4利用MSCs和淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)的體系研究MSCs分泌的IGFBP7是否對(duì)T細(xì)胞及其亞群的增殖和促炎因子的分泌有直接的抑制作用。利用流式細(xì)胞檢測(cè)羥基熒光素二醋酸鹽琥珀酰亞胺脂(5,6-carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester,CFSE)熒光素的強(qiáng)度變化反映T細(xì)胞增殖情況;以細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子染色手段檢測(cè)腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和γ-干擾素(IFN-γ)的比例以反映MSCs對(duì)T細(xì)胞炎癥因子分泌的抑制效果;2.5同時(shí)利用共培養(yǎng)的體系研究MSCs分泌的IGFBP7是否對(duì)T細(xì)胞及其亞群的凋亡和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Tregs)有直接的促進(jìn)作用。利用流式細(xì)胞檢測(cè)Annexin V和PI反映T細(xì)胞的凋亡情況;利用流式細(xì)胞檢測(cè)CD4+CD25+Foxp3+細(xì)胞的反映Tregs的比例變化。2.6為了闡明IGFBP7抑制T細(xì)胞增殖和促炎因子分泌的作用機(jī)制,將共培養(yǎng)后的T細(xì)胞用流式檢測(cè)其細(xì)胞周期以及用蛋白質(zhì)印跡(Western blot)的方法檢測(cè)相關(guān)信號(hào)通路的蛋白表達(dá)情況。2.7利用三硝基苯磺酸(trinitro-benzene-sulfonicacid,TNBS)誘導(dǎo),建立小鼠實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎模型,并通過(guò)小鼠腹腔注射MSCs細(xì)胞(治療組)或生理鹽水(治療對(duì)照組)研究MSCs的治療效果。連續(xù)7天記錄模型組與對(duì)照組的體重變化情況,觀察并記錄小鼠的癥狀以及死亡情況。小鼠解剖后將結(jié)腸取出觀察和分析結(jié)腸的大體情況以及長(zhǎng)度變化;HE染色反映腸組織的炎癥浸潤(rùn)程度,免疫熒光染色反映結(jié)腸組織中免疫細(xì)胞類(lèi)型的變化情況。將造模后第二天的小鼠的腸系膜淋巴結(jié)(Mesenteric Lymph Nodes,MLNs)取出,直接流式細(xì)胞檢測(cè)或者與MSCs體外共培養(yǎng)3天后再做流式細(xì)胞檢測(cè)以觀察IGFBP7是否在小鼠體內(nèi)或者體外環(huán)境中對(duì)MLNs中的T細(xì)胞的增殖和炎癥因子分泌有抑制作用。3.結(jié)果3.1 Q-PCR檢測(cè)證實(shí)IGFBP7是該家族成員中在小鼠骨髓MSCs中表達(dá)最高的分子。3.2在MSCs中下調(diào)IGFBP7分子的表達(dá)未改變其表面分子的表達(dá)(如Sca-1、CD106和CD44等)、不影響小鼠MSCs的增殖速率及成骨,成脂和成軟骨分化的能力。3.3體外實(shí)驗(yàn)中,小鼠MSCs分泌的IGFBP7能夠抑制T細(xì)胞的增殖和促炎因子TNF-α和IFN-γ的分泌;不影響T細(xì)胞的凋亡和Tregs的比例。3.4 IGFBP7可以抑制PI3K/AKT和MAPK/ERK信號(hào)通路的激活,進(jìn)而阻礙T細(xì)胞的細(xì)胞周期,使其阻滯于G0/G1期;可以抑制NF-κB信號(hào)通路的激活以抑制促炎因子的分泌。3.5動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中,小鼠MSCs分泌的IGFBP7可以緩解TNBS誘導(dǎo)的小鼠實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎的癥狀。包括有效抑制小鼠體重下降,提高小鼠生存率和生存質(zhì)量;抑制結(jié)腸的縮短和充血水腫,降低結(jié)腸的炎癥浸潤(rùn)程度,抑制腸道組織炎癥反應(yīng)。3.6小鼠MSCs可以通過(guò)IGFBP7分子顯著抑制小鼠實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎模型中MLNs內(nèi)的T細(xì)胞的增殖和促炎因子TNF-α和IFN-γ的分泌,而不影響MLNs中的Tregs的比例。4.結(jié)論4.1本研究首次發(fā)現(xiàn)IGFBP7分子參與小鼠MSCs的免疫調(diào)節(jié)作用,表現(xiàn)為抑制T細(xì)胞的增殖和促炎因子的分泌。4.2 MSCs分泌的IGFBP7可以通過(guò)抑制T細(xì)胞中PI3K/AKT和MAPK/ERK信號(hào)通路的激活促使T細(xì)胞的細(xì)胞周期停留在G0/G1期,進(jìn)而抑制其增殖;通過(guò)抑制NF-κB信號(hào)通路的激活抑制T細(xì)胞中促炎因子的分泌。4.3進(jìn)一步體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證實(shí),MSCs具有治療小鼠實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎的作用,而降低IGFBP7的表達(dá)顯著抑制了MSCs的治療作用,上述體內(nèi)外研究結(jié)果證實(shí)IGFBP7在MSCs免疫調(diào)節(jié)作用中的重要角色。第二部分心臟來(lái)源的Nestin+MSCs治療小鼠急性心肌梗死模型中的作用機(jī)制初探1.目的近年來(lái)研究顯示,除骨髓外,在脂肪、臍帶、腎臟、心臟等多種臟器或組織中均有MSCs的存在,并表現(xiàn)出類(lèi)似的修復(fù)病損組織的功能。本課題組前期的研究證明,從Nestin-GFP小鼠睪丸和腎臟內(nèi)來(lái)源的Nestin+睪丸和腎臟間質(zhì)干細(xì)胞具有修復(fù)其靶器官的組織損傷的功能。進(jìn)一步從小鼠心臟中分離得到的Nestin+細(xì)胞具有間質(zhì)干細(xì)胞特性,并在修復(fù)心肌組織損傷中表現(xiàn)出優(yōu)于骨髓Nestin+MSCs的治療作用。但是,其治療心肌損傷修復(fù)的作用機(jī)制尚不清楚,有待于深入闡明。2.方法2.1選取出生后7天的Nestin-GFP小鼠分離消化心臟組織,并利用流式細(xì)胞分選方法分選出GFP+的Nestin細(xì)胞并在體外無(wú)血清含有多種生長(zhǎng)因子(如b FGF、EGF、N2、B27和CT-1)的條件下擴(kuò)增培養(yǎng)。2.2將單個(gè)細(xì)胞接種在96孔板的1個(gè)孔中,并分別在不同的時(shí)間點(diǎn)(0、3、7和10天)鑒定細(xì)胞自我更新的能力。2.3在不同的分化培養(yǎng)基中誘導(dǎo)Nestin+細(xì)胞向成骨、成脂和成軟骨分化。2.4利用流式細(xì)胞方法檢測(cè)心臟來(lái)源的Nestin+細(xì)胞的MSCs有關(guān)的表面標(biāo)志物的表達(dá)情況,包括Sca-1、c-kit、CD44、CD106、CD90、CD45和CD11b。2.5利用永久結(jié)扎小鼠左心室冠狀動(dòng)脈前降支的方法建立小鼠急性心肌梗死(AMI)模型,并將模型小鼠分為三組,分別在缺血區(qū)心肌內(nèi)注射25μl生理鹽水(Saline組)、25μl生理鹽水含3×105個(gè)小鼠骨髓來(lái)源的Nestin+MSCs(Nes+MSCs組)或者心臟來(lái)源的Nestin+c MSCs(Nes+c MSCs組)。2.6在細(xì)胞治療AMI后的1周和3周時(shí),利用超聲心動(dòng)圖檢測(cè)小鼠心功能的各項(xiàng)指標(biāo),包括左心室射血分?jǐn)?shù)(Left Ventricular Ejection Fraction,LVEF)、左心室縮短分?jǐn)?shù)(Left Ventricular Fractional Shortening,LVFS)、左心室舒張末期容積(Left Ventricular End-diastolic Volume,LVEDV)和左心室收縮末期容積(Left Ventricular End-systolic Volume,LVESV)等。在細(xì)胞治療AMI后的3周,利用masson三色染色檢測(cè)各組小鼠的心肌纖維化的程度。2.7利用HE染色反映心肌內(nèi)的炎癥反應(yīng)情況;已有文獻(xiàn)報(bào)道巨噬細(xì)胞在AMI后的修復(fù)過(guò)程中發(fā)揮重要的功能,同時(shí)利用免疫熒光染色、流式檢測(cè)、Q-PCR和酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(enzyme-linkedimmunosorbentassay,ELISA)等方法在體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中深入觀察Nestin+c MSCs對(duì)巨噬細(xì)胞亞群的影響。2.8利用陰離子巨噬細(xì)胞去除劑去除小鼠體內(nèi)的巨噬細(xì)胞后,再利用上述方法檢測(cè)其對(duì)AMI模型小鼠心功能以及梗死區(qū)內(nèi)免疫反應(yīng)的影響。2.9利用Q-PCR檢測(cè)在Nestin+c MSCs中可能參與損傷修復(fù)作用的旁分泌因子。2.10基因檢測(cè)結(jié)果顯示periostin基因在Nestin+c MSCs中表達(dá)。利用RNA干擾技術(shù)下調(diào)periostin的表達(dá),且利用體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證periostin表達(dá)下調(diào)后的Nestin+c MSCs是否影響心肌梗死的治療作用,以及是否對(duì)巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)型發(fā)揮重要的作用。3.結(jié)果3.1心臟來(lái)源的Nestin+細(xì)胞具有自我更新能力,表達(dá)間質(zhì)干細(xì)胞相關(guān)的表面標(biāo)志物,同時(shí)具有向中胚層的骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞和脂肪細(xì)胞分化的能力。因此,將這群細(xì)胞定義為心臟來(lái)源的Nestin+間質(zhì)干細(xì)胞,簡(jiǎn)稱(chēng)Nestin+c MSCs。3.2建立小鼠急性心肌梗死模型,將3×105個(gè)心臟來(lái)源的Nestin+c MSC和骨髓來(lái)源的Nestin+MSCs心肌內(nèi)注射移植于小鼠心肌梗死區(qū)。超聲心動(dòng)圖檢測(cè)顯示,相比于生理鹽水治療組,Nestin+MSCs移植后1周和3周的時(shí)候可以明顯增加LVEF和LVFS的值,同時(shí)顯著降低LVEDV和LVESV的值;同時(shí)Nestin+MSCs明顯減少心肌纖維化的程度,促進(jìn)心臟的修復(fù)。而心臟來(lái)源的Nestin+c MSCs的治療效果優(yōu)于骨髓來(lái)源的Nestin+MSCs,表現(xiàn)為可以更加顯著增加LVEF和LVFS的值,以及降低LVEDV和LVESV的值;并且改善心肌纖維化程度比Nestin+MSCs治療組更為明顯。3.3通過(guò)HE染色發(fā)現(xiàn)Nestin+c MSCs可以有效的抑制AMI后心梗區(qū)內(nèi)的炎癥反應(yīng)。已有文章報(bào)道巨噬細(xì)胞在心肌損傷的修復(fù)中扮演了重要的角色。為探討Nestin+c MSCs治療AMI的機(jī)制,將檢測(cè)巨噬細(xì)胞的變化情況。發(fā)現(xiàn)Nestin+c MSCs移植可以明顯減少梗死區(qū)內(nèi)促炎的M1型巨噬細(xì)胞數(shù)量,并且明顯增加在梗死區(qū)內(nèi)抑炎的M2型巨噬細(xì)胞數(shù)量。3.4體外共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示Nestin+c MSCs可以抑制活化的巨噬細(xì)胞向促炎的M1型分化,促進(jìn)其向抑炎型M2型巨噬細(xì)胞分化。同時(shí)抑制M1型巨噬細(xì)胞分泌促炎因子TNF-α和IFN-γ,而促進(jìn)M2型巨噬細(xì)胞分泌抑炎因子IL-10。3.5利用陰離子巨噬細(xì)胞去除劑將小鼠體內(nèi)的巨噬細(xì)胞清除后再輸注Nestin+c MSCs,發(fā)現(xiàn)其治療AMI小鼠模型的作用明顯下降提示巨噬細(xì)胞數(shù)量和功能的改變可能在Nestin+c MSCs促進(jìn)AMI模型小鼠心肌損傷修復(fù)中發(fā)揮了重要作用。3.6通過(guò)Q-PCR篩查發(fā)現(xiàn)在Nestin+c MSCs細(xì)胞中高表達(dá)巨噬細(xì)胞調(diào)節(jié)相關(guān)基因Periostin,并利用RNA干擾技術(shù)成功的下調(diào)了Periostin在Nestin+c MSCs中的表達(dá)。3.7 Periostin表達(dá)下調(diào)的Nestin+c MSCs在AMI小鼠模型中修復(fù)損傷心肌組織的能力明顯下降,表現(xiàn)為梗死區(qū)內(nèi)炎癥反應(yīng)沒(méi)有明顯改善,梗死區(qū)內(nèi)M2型巨噬細(xì)胞的數(shù)量減少。3.8 Nestin+c MSCs分泌的periostin不僅增加梗死區(qū)內(nèi)的M2型巨噬細(xì)胞的比例,還可以促進(jìn)M2型巨噬細(xì)胞分泌抑炎因子IL-10,在AMI后的免疫抑制過(guò)程中發(fā)揮至關(guān)重要的作用。4.結(jié)論4.1心臟來(lái)源的Nestin+細(xì)胞是一群具有間質(zhì)干細(xì)胞特性的細(xì)胞,因此,將這群細(xì)胞定義為心臟來(lái)源的Nestin+間質(zhì)干細(xì)胞,簡(jiǎn)稱(chēng)Nestin+c MSCs。4.2 Nestin+c MSCs可以有效的緩解心肌梗死的癥狀,促進(jìn)心肌的修復(fù)和心臟功能的恢復(fù),表現(xiàn)為顯著提高LVEF和LVFS,并明顯的降低LVEDV和LVESV,同時(shí)可以減少心肌纖維化的面積,且其治療效果優(yōu)于骨髓來(lái)源的Nestin+MSCs。4.3機(jī)理研究發(fā)現(xiàn),Nestin+c MSCs通過(guò)抑制進(jìn)入梗死區(qū)內(nèi)促炎的M1型巨噬細(xì)胞,且增加抑炎的M2型巨噬細(xì)胞的比例,從而發(fā)揮損傷修復(fù)的作用。4.4 Nestin+c MSCs分泌的periostin分子可以增加抑炎的M2型巨噬細(xì)胞的比例并通過(guò)分泌IL-10發(fā)揮抑炎的作用,從而促進(jìn)心臟組織的修復(fù)并有助于心功能的改善。
【學(xué)位授予單位】：中山大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：R329.2
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本文編號(hào)：1332954