本文關(guān)鍵詞：云南省埃及伊蚊種群遺傳特征研究　出處：《中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院》2017年博士論文　論文類(lèi)型：學(xué)位論文

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【摘要】：登革熱是由登革病毒引起的一種重要蟲(chóng)媒傳染病,近年來(lái),全球登革熱發(fā)病率急劇上升,有100多個(gè)國(guó)家呈地方性流行,其中東南亞是受侵襲最嚴(yán)重的地區(qū)之一。云南省在歷史記載中有過(guò)少量登革熱輸入病例的報(bào)道,但自從2008年開(kāi)始出現(xiàn)本地感染病例以后,尤其是2013年以來(lái)云南省已經(jīng)多次發(fā)生由輸入病例引起的本地感染登革熱疫情暴發(fā)。埃及伊蚊是重要的醫(yī)學(xué)昆蟲(chóng),是登革熱的主要傳播媒介。埃及伊蚊起源于非洲,主要分布在熱帶和亞熱帶地區(qū)。雖然其飛行擴(kuò)散距離有限,但可以通過(guò)成蚊、蛹、幼蟲(chóng)、卵等方式隨著飛機(jī)、輪船、汽車(chē)運(yùn)輸或其他人類(lèi)活動(dòng)而發(fā)生遠(yuǎn)距離的被動(dòng)擴(kuò)散,在19世紀(jì)后期通過(guò)航運(yùn)入侵到東南亞。2000年以前,埃及伊蚊在我國(guó)的分布也僅限于北緯22°以南地區(qū),包括臺(tái)灣南部、海南以及廣東、廣西的部分地區(qū)和個(gè)別島嶼,在云南省并未有過(guò)埃及伊蚊的記載。然而,全球化發(fā)展以及全球氣候變暖,為媒介生物的擴(kuò)散提供了更加便利的條件。自2002年2月首次在云南省發(fā)現(xiàn)埃及伊蚊以來(lái),現(xiàn)已在瑞麗、芒市、勐臘、勐海、景洪、盈江、隴川、瀘水、耿馬等地陸續(xù)發(fā)現(xiàn),且分布范圍和種群數(shù)量不斷擴(kuò)大,入侵和擴(kuò)散形勢(shì)非常嚴(yán)峻,埃及伊蚊已經(jīng)成為了云南省的一個(gè)重要外來(lái)入侵蚊種。而且,與云南省接壤的越南、緬甸和老撾等國(guó)家均有埃及伊蚊且登革熱頻發(fā),埃及伊蚊的入侵則加重了云南省登革熱暴發(fā)和流行的風(fēng)險(xiǎn)。但是,目前對(duì)我國(guó)云南省的埃及伊蚊研究大多僅限于分布調(diào)查層面上,對(duì)于其種群遺傳分化及特征、抗藥性水平及機(jī)制等方面缺乏深入研究�；谝陨显�,本研究以云南省埃及伊蚊為研究對(duì)象,通過(guò)現(xiàn)場(chǎng)采集云南省不同地區(qū)的埃及伊蚊自然種群,主要從兩個(gè)方面予以深入研究。一是提取基因組DNA,綜合利用微衛(wèi)星DNA標(biāo)記和線粒體DNA基因CO I、ND4、ND5進(jìn)行種群遺傳特征研究,以期了解和掌握云南省埃及伊蚊種群遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)特征,并對(duì)其種群結(jié)構(gòu)和入侵事件予以探討;二是將現(xiàn)場(chǎng)采集的埃及伊蚊進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室傳代養(yǎng)殖后,通過(guò)蚊蟲(chóng)抗藥性生物學(xué)測(cè)定、代謝酶活性以及靶標(biāo)基因的檢測(cè),掌握云南省埃及伊蚊對(duì)常用殺蟲(chóng)劑的抗藥性水平和抗藥性分子特征,為化學(xué)殺蟲(chóng)劑防治埃及伊蚊提供科學(xué)依據(jù)。本研究結(jié)果如下:1、微衛(wèi)星研究結(jié)果本研究通過(guò)文獻(xiàn)查找,篩選獲得的9個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)容易擴(kuò)增且穩(wěn)定性好、差異性明顯、多態(tài)信息含量高(PIC=0.392~0.886)。結(jié)果表明所選用的9個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)能夠充分滿(mǎn)足本研究的需要,每個(gè)種群的樣本采集量能夠滿(mǎn)足研究的樣本含量需求。9個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)從28個(gè)埃及伊蚊自然種群中共獲得等位基因數(shù)114個(gè),平均每個(gè)位點(diǎn)獲得等位基因數(shù)12.67個(gè)。從位點(diǎn)角度分析看,每個(gè)位點(diǎn)平均在每個(gè)種群獲得的等位基因在3.46~7.14之間。各種群的基因豐富度在3.34~5.72之間,瑞麗和景洪兩地埃及伊蚊的種群基因豐富度較為接近,且均高于2016年在其他邊境地區(qū)采集的埃及伊蚊種群。云南省埃及伊蚊種群總體上具有較高的遺傳多樣性,9個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)的觀察雜合度在0.108~0.939之間,平均觀察雜合度為0.579;而期望雜合度在0.367~0.760之間,平均期望雜合度為0.592。各種群的觀察雜合度在0.401~0.689之間,其中2016年在其他邊境地區(qū)采集的8個(gè)種群觀察雜合度高于期望雜合度,瑞麗和景洪地區(qū)采集的20個(gè)種群均為觀察雜合度低于期望雜合度�；蛐瓦B鎖不平衡分析顯示云南28個(gè)埃及伊蚊自然種群的9個(gè)位點(diǎn)之間的1008對(duì)位點(diǎn)中,有166對(duì)位點(diǎn)存在著顯著的連鎖情況(P0.05),其他位點(diǎn)均表現(xiàn)為獨(dú)立遺傳(P0.05)。哈迪溫伯格平衡檢驗(yàn)顯示28個(gè)種群中僅有景洪(GLR)、勐海(M1H)2個(gè)種群發(fā)生了哈溫平衡偏離。采用TPM和SMM兩種模式檢測(cè)云南埃及伊蚊種群近期是否經(jīng)歷遺傳瓶頸效應(yīng),結(jié)果顯示共有10個(gè)自然種群產(chǎn)生了瓶頸效應(yīng),其中瑞麗地區(qū)采集的10個(gè)種群中有6個(gè)(MNL、JDL、JGH、JCG、GMG、CXT)種群產(chǎn)生了瓶頸效應(yīng),占瑞麗地區(qū)種群的60%;2016年在其他邊境地區(qū)采集的8個(gè)自然種群中有4個(gè)產(chǎn)生了瓶頸效應(yīng),占50%;而景洪地區(qū)采集的10個(gè)種群均沒(méi)有產(chǎn)生瓶頸效應(yīng)。近交系數(shù)結(jié)果顯示2016年在其他邊境地區(qū)采集的8個(gè)種群中有7個(gè)種群的近交系數(shù)均為負(fù)數(shù),表示這7個(gè)種群近交程度很低,而其他種群的近交系數(shù)為正值,意味著這些種群存在不同程度的近交。成對(duì)固定指數(shù)(FST)分析顯示,各種群間僅有17個(gè)成對(duì)固定指數(shù)(FST)未表現(xiàn)出明顯的遺傳分化,其余361個(gè)成對(duì)固定指數(shù)(FST)均表現(xiàn)出明顯的遺傳分化。應(yīng)用STRUCTRUE軟件對(duì)各個(gè)個(gè)體的聚類(lèi)分析,結(jié)合群體內(nèi)遺傳差異數(shù)據(jù),結(jié)果顯示當(dāng)K=3時(shí),將云南省不同地區(qū)的28個(gè)埃及伊蚊種群分為3類(lèi)較為合理,瑞麗地區(qū)采集的10個(gè)種群、景洪地區(qū)采集的10個(gè)種群以及2016年在其他邊境地區(qū)采集8個(gè)種群各聚成1類(lèi)�；贜ei’s標(biāo)準(zhǔn)遺傳距離應(yīng)用UPGMA構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)與PCoA圖譜分析也顯示同樣的結(jié)果。分子方差分析(AMOVA)表明不同組之間存在明顯的分化,占14.51%;同一區(qū)域內(nèi)不同種群之間的遺傳分化占總的6.01%;來(lái)自個(gè)體之間的遺傳分化最為顯著,占77.76%。相關(guān)性分析顯示地理距離和遺傳分化之間呈現(xiàn)正相關(guān)(r=0.4948,P0.0001)。綜合分析判斷,2002年發(fā)現(xiàn)的瑞麗入侵和2013年發(fā)現(xiàn)的景洪入侵應(yīng)為不同的入侵事件,而2016年采集的其他邊境地區(qū)仍然存在著持續(xù)的多點(diǎn)入侵。2、線粒體DNA研究結(jié)果本研究分析了云南省瑞麗和景洪地區(qū)20個(gè)不同的埃及伊蚊地理種群的線粒體基因CO I、ND4和ND5的基因多樣性指數(shù),結(jié)果顯示CO I基因A+T的含量為66.9%,共獲得381個(gè)多態(tài)性位點(diǎn),多態(tài)性位點(diǎn)占?jí)A基總數(shù)的45.36%(其中包括66個(gè)自裔位點(diǎn)和315個(gè)簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)),共獲得單倍型14種,總?cè)后w核苷酸多樣性指數(shù)為0.02265、單倍型多樣性指數(shù)為0.5583。ND4基因A+T的含量為70.0%,共獲得334個(gè)多態(tài)性位點(diǎn),多態(tài)性位點(diǎn)占?jí)A基總數(shù)的55.76%(其中包括126個(gè)自裔位點(diǎn)和191個(gè)簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)),共獲得單倍型18個(gè),總?cè)后w核苷酸多樣性指數(shù)為0.01860、基因單倍型多樣性指數(shù)為0.47156。ND5基因A+T的含量為74.6%,共獲得369個(gè)多態(tài)性位點(diǎn),多態(tài)性位點(diǎn)占?jí)A基總數(shù)的60.89%(其中包括109個(gè)自裔位點(diǎn)和254個(gè)簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)),共獲得單倍型5種,總?cè)后w核苷酸多樣性指數(shù)為0.07223、單倍型多樣性指數(shù)為0.5098。由于ND5基因片段的單倍型較少(僅5種),本研究?jī)H利用CO I和ND4對(duì)瑞麗和景洪地區(qū)的20個(gè)埃及伊蚊地理種群進(jìn)行了遺傳分化和遺傳結(jié)構(gòu)研究。基于CO I基因的遺傳分化結(jié)果顯示景洪的GGH種群與瑞麗的MNL、BFC、HDH、BNS等4個(gè)種群遺傳分化不顯著,反而與景洪地區(qū)的GXS、JBQ、YSC、DMY、GSZ、NKH等5個(gè)種群間具有明顯的遺傳分化。而基于ND4基因的遺傳分化結(jié)果顯示瑞麗的HDH種群與景洪的LJY、JBQ、YSC三個(gè)種群間不存在明顯的遺傳分化,更有意思的是,該種群與瑞麗地區(qū)其他9個(gè)種群具有明顯的遺傳分化。說(shuō)明瑞麗和景洪地區(qū)的埃及伊蚊種群間可能存在著相互交流。基于CO I和ND4基因的遺傳分化結(jié)果均顯示,景洪地區(qū)各種群間遺傳分化水平明顯低于瑞麗地區(qū)各種群間的遺傳分化。這一結(jié)果與微衛(wèi)星研究的結(jié)果相似。線粒體CO I和ND4基因單倍型雖然能夠被網(wǎng)絡(luò)圖分布格局與NJ進(jìn)化樹(shù)分化為2個(gè)分支,但結(jié)合各單倍型的地理種群分布,無(wú)法進(jìn)行非常清楚地分支。Tajima’S D和Fu’s FS中性檢驗(yàn)出現(xiàn)了顯著的負(fù)值,核苷酸錯(cuò)配分布顯示分布曲線均呈單峰結(jié)構(gòu)形式,這些結(jié)果都說(shuō)明這些地區(qū)的埃及伊蚊經(jīng)歷了明顯的種群擴(kuò)張。3、抗藥性生物學(xué)測(cè)定結(jié)果以實(shí)驗(yàn)室養(yǎng)殖的云南埃及伊蚊敏感株為參照,采用敏感基線法對(duì)幼蟲(chóng)進(jìn)行生物學(xué)測(cè)定,三種殺蟲(chóng)劑的毒力以殘殺威最低(LC50=1.02882mg/L,95%CI:0.97708~1.08173 mg/L),其次為敵敵畏(LC50=0.0367 mg/L,95%CI:0.03580~0.03770 mg/L),高效氯氰菊酯毒力最高(LC50=0.00102 mg/L,95%CI:0.00088~0.00118 mg/L)。對(duì)2016年在云南省西雙版納傣族自治州和德宏州采集的12個(gè)埃及伊蚊自然種群幼蟲(chóng)的生物學(xué)測(cè)定結(jié)果顯示,對(duì)高效氯氰菊酯的抗性倍數(shù)在11.31~41.56之間,而對(duì)敵敵畏和殘殺威雖然抗性水平略有升高,尚未達(dá)到抗性種群的標(biāo)準(zhǔn)。通過(guò)敏感基線法獲得云南埃及伊蚊敏感株的對(duì)三種殺蟲(chóng)劑的成蚊診斷劑量分別為殘殺威983.41 mg/L、敵敵畏181.95 mg/L、高效氯氰菊酯1493.37mg/L。以診斷劑量法對(duì)各自然種群埃及伊蚊成蚊進(jìn)行生物學(xué)測(cè)定,成蚊生物學(xué)測(cè)定結(jié)果也顯示只對(duì)高效氯氰菊酯產(chǎn)生了抗藥性,成蚊生測(cè)結(jié)果與幼蟲(chóng)生測(cè)結(jié)果基本一致。4、代謝解毒酶活性檢測(cè)結(jié)果本研究采用WHO推薦的生物化學(xué)測(cè)定法檢測(cè)了云南埃及伊蚊各自然種群的代謝解毒酶活性,結(jié)果顯示:各野外種群在受到殘殺威抑制作用后,ACHE活性為未受抑制作用的22.36-31.60%之間,其中僅有J-3和J-5略高于30%;以α-Naphthyl Acetate為底物檢測(cè)得到敏感株EST(1-N)活性均值為111.1717±34.9588 nmole of 1-naphthol/min/mg protein,而野外種群的EST(1-N)活性均值在41.7940 nmole of 1-naphthol/min/mg protein~198.5297nmole of 1-naphthol/min/mg protein之間;以β-Naphthyl Acetate為底物檢測(cè)得到敏感株EST(2-N)活性為135.4011±47.3301 nmole of 2-naphthol/min/mg protein,野外種群的EST(2-N)活性在39.7117 nmole of 2-naphthol/min/mg protein~214.0106 nmole of 2-naphthol/min/mg protein之間;敏感株MFO活性為3.08±3.77nmol cytochrome C/mg protein,野外種群的MFO活性在5.43 nmol cytochrome C/mg protein~20.11 nmol cytochrome C/mg protein之間,與敏感株相比,野外種群的MFO活性均高于敏感種群;敏感株GST活性為1.2504±0.3961 nmol of CDNB/min/mg protein,野外種群的GST活性在0.6178 nmol of CDNB/min/mg protein~3.4939 nmol of CDNB/min/mg protein之間。上述結(jié)果中僅有MFO在所有野外種群中的酶活性升高,而其他代謝酶在不同種群中的表現(xiàn)不一,這一結(jié)果提示云南埃及伊蚊對(duì)高效氯氰菊酯的抗藥性可能主要與MFO酶活性升高有關(guān)。對(duì)于酶活性水平與生物學(xué)測(cè)定之間結(jié)果差異的原因有待進(jìn)一步研究。5、靶標(biāo)抗性檢測(cè)結(jié)果本研究發(fā)現(xiàn)云南埃及伊蚊野外株鈉離子通道氨基酸序列第1534位點(diǎn)的氨基酸突變,由F突變?yōu)镃,相對(duì)應(yīng)的堿基TTC突變?yōu)門(mén)GC,未發(fā)現(xiàn)其他突變位點(diǎn)。相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)這個(gè)點(diǎn)的突變僅與對(duì)殺蟲(chóng)劑高效氯氰菊酯抗藥性成正相關(guān),未發(fā)現(xiàn)與對(duì)殘殺威和敵敵畏抗藥性有關(guān)。
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類(lèi)號(hào)】：R384.1

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