本文關(guān)鍵詞：ENTV和enENTV全基因組分析及ENA組織miRNA差異表達(dá)分析　出處：《四川農(nóng)業(yè)大學(xué)》2016年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：羊地方性鼻內(nèi)腺瘤(Enzootic Nasal Adenocarcinoma,ENA)又稱羊地方性鼻內(nèi)腫瘤(enzootic nasal Tumor,ENT)或山羊傳染性鼻內(nèi)腺癌,是由地方性鼻內(nèi)腫瘤病毒(Enzootic Nasal Tumor Virus of Goats,ENTV-2,Enzootic Nasal Tumor Virus of Sheep, ENTV-1)引起的一種慢性、進(jìn)行性、接觸性傳染病,除澳大利亞和新西蘭外,該病呈世界性分布。臨床表現(xiàn)為食欲減退,極度消瘦,呼吸困難,鼻漏,出現(xiàn)鼻內(nèi)單側(cè)或雙側(cè)性增生物。該病發(fā)病率為5%-15%不等,一旦出現(xiàn)臨床癥狀,幾乎都以死亡告終。迄今為止該病沒(méi)有有效的方法進(jìn)行早期診斷,一旦出現(xiàn)臨床癥狀就只能淘汰,也不能區(qū)分潛伏感染的羊只,導(dǎo)致疾病在整個(gè)羊群中散布,嚴(yán)重地威脅羊群的安全。至今,還未能成功建立ENTV的體外培養(yǎng)體系,使得研究該病毒的致瘤機(jī)制和免疫特性遇到了阻礙。本研究對(duì)ENTV-2及其對(duì)應(yīng)的內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒進(jìn)行了全基因組測(cè)序,并進(jìn)行了比對(duì)分析,分析了ENTV-2在病毒基因?qū)用娴闹铝鰴C(jī)制及鑒別內(nèi)外源ENTV-2的靶基因位點(diǎn)；通過(guò)對(duì)ENA腫瘤組織及癌旁組織進(jìn)行高通量測(cè)序,建立了miRNA文庫(kù),分析miRNA在山羊鼻腫瘤組織和癌旁組織中的表達(dá)差異,利用生物信息學(xué)軟件分析差異性表達(dá)miRNA的靶標(biāo)及相應(yīng)的生物學(xué)功能,分析miRNA在腫瘤形成中的作用,為進(jìn)一步研究miRNA在ENA中的作用和機(jī)制提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù),在表觀遺傳層面研究ENTV-2的致瘤機(jī)制。1.山羊致病性鼻內(nèi)腺瘤病毒全基因組序列測(cè)定及分析通過(guò)分段RT-PCR方法從6例ENA山羊鼻內(nèi)腫瘤組織中擴(kuò)增出6條ENTV-2全基因序列。ENTV-2 CHN6全長(zhǎng)7500nt, ENTV-2 CHN7全長(zhǎng)7501nt,ENTV-2 CHN8全長(zhǎng)7501nt,ENTV-2 CHN9全長(zhǎng)7503nt,ENTV-2 CHN10全長(zhǎng)7500nt,ENTV-2 CHN11全長(zhǎng)7499nt。將所得序列與GenBank中收錄的ENTV-2和ENTV-SC進(jìn)行全基因比對(duì),6個(gè)全基因組序列與ENTV-2的同源性均高于87%,與ENTV-SC的同源性均高于91%,具有較高的同源性,并且具有ENTV的gag和env基因的特征區(qū)域。經(jīng)過(guò)比對(duì),發(fā)現(xiàn)ENTV-2和ENTV-1的基因組的突變區(qū)域主要集中在LTR的U5、U3區(qū)域,gag和env區(qū)域。ENTV-2與JSRV的基因組同源性約為84-89%,ENTV-1與比對(duì)的JSRV的基因組同源性為88.4-89.6%。ENTV-1與ENTV-2和JSRV的同源性比較接近。突變區(qū)主要集中在170bp以前和7400bp以后,即突變區(qū)主要集中在U5區(qū)、U3區(qū)和env基因末端。6株病毒株ENTV-2 CHN6-ENTV-2 CHN11的核苷酸突變以點(diǎn)突變?yōu)橹?只有LTR區(qū)有2bp的插入突變和2bp的缺失突變,編碼區(qū)的突變均為點(diǎn)突變,但突變并未引起編碼蛋白的結(jié)構(gòu)域和功能的改變。分析發(fā)現(xiàn),6株病毒株ENTV-2 CHN6-ENTV-2 CHN11的基因組存在點(diǎn)突變導(dǎo)致的變異,經(jīng)生物軟件分析突變尚未積累到影響病毒的結(jié)構(gòu)蛋白的空間構(gòu)型的改變。2.山羊內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒全基因組序列測(cè)定及分析通過(guò)分段PCR方法,從6例ENA山羊腎臟中擴(kuò)增出6條enENTV。enENTV-CHN 1全長(zhǎng)7889bp,enENTV-CHN2全長(zhǎng)7890bp,enENTV-CHN3全長(zhǎng)7897bp,enENTV-CHN4全長(zhǎng)7891bp,enENTV-CHN5全長(zhǎng)7928bp,enENTV-CHN6全長(zhǎng)7921bp。將所得序列與GenBank中收錄的ENTV-2和ENTV-SC進(jìn)行全基因比對(duì),6個(gè)全基因組序列與ENTV-2的同源性均高于87%,與ENTV-SC的同源性均高于91%,具有較高的同源性,并且具有ENTV的gag和env基因的特征區(qū)域。enENTV與同源ENTV的核苷酸突變區(qū)主要集中在U3、U5、gag 3'端和env 3'端。通過(guò)全基因組同源性分析及序列分析發(fā)現(xiàn)enENTV遺傳比較穩(wěn)定,本次獲得enENTV-CHN1～6突變具有地域差異但與性別相關(guān)性不明顯。通過(guò)全基因組序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)enENTV與ENTV-2相比具有5處連續(xù)突變,該區(qū)域可以作為區(qū)別鑒定enENTV與ENTV-2靶基因位點(diǎn)。3. ENTV-2 RT-PCR檢測(cè)方法的建立通過(guò)全基因組序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)enENTV與ENTV-2相比在LTR U3區(qū)具有5處連續(xù)突變,7453bp處ENTV-2 CHN6-11有7bp插入突變,7828bp處3bp插入突變,針對(duì)ENTV-2相對(duì)enENTV的插入突變區(qū)設(shè)計(jì)了一對(duì)引物,對(duì)鑒別ENTV-2與enENTV的靶基因位點(diǎn)進(jìn)行了驗(yàn)證,建立ENTV的快速RT-PCR檢測(cè)方法。用該引物進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增,結(jié)果得到與試驗(yàn)預(yù)計(jì)相符的391bp的特異性擴(kuò)增條帶,與ENTV-2CHN6-11比對(duì)同源性均高于99%；此方法對(duì)健康羊鼻粘膜上皮、肺炎鏈球菌和支原體的擴(kuò)增結(jié)果均為陰性,最低能檢測(cè)10 pg的RNA,有較好的穩(wěn)定性和重復(fù)性；對(duì)保存的100份病料進(jìn)行檢測(cè),并與臨床診斷結(jié)果進(jìn)行比較,符合率100%。試驗(yàn)表明全基因組序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)的靶基因位點(diǎn)可以用于ENTV-2與enENTV的鑒別。4.山羊鼻內(nèi)腺瘤miRNA測(cè)序及表達(dá)差異分析應(yīng)用Illumina高通量測(cè)序技術(shù),對(duì)ENA山羊鼻內(nèi)腺瘤及癌旁組織進(jìn)行miRNA測(cè)序,建立miRNA文庫(kù),并對(duì)山羊鼻內(nèi)腺瘤組織和癌旁組織中miRNA的表達(dá)差異進(jìn)行了分析。利用生物信息學(xué)軟件分析差異性表達(dá)miRNA的靶標(biāo)及相應(yīng)的生物學(xué)功能,進(jìn)一步分析miRNA在腫瘤形成中的作用。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)406條已知miRNA,29條新miRNA,其中只在腫瘤組或?qū)φ战M表達(dá)的有34條(包含3條新miRNA),在腫瘤組和對(duì)照組中有116條miRNA有表達(dá)差異顯著,與對(duì)照組比較,其中54條miRNA在腫瘤組中表達(dá)下調(diào),60條miRNA在腫瘤組織中表達(dá)上調(diào),有2條只在對(duì)照組中表達(dá)。另外,在功能分析中,預(yù)測(cè)出顯著差異表達(dá)121 miRNA(116條顯著差異表達(dá)的miRNA和5條star序列)的靶標(biāo)、6172條、1792條顯著富集GO和97條顯著富集KEGG pathway、GO和KEGG pathway功能分析顯示大部分基因涉及到細(xì)胞分化、信號(hào)傳導(dǎo)等重要生命過(guò)程。本試驗(yàn)第一次對(duì)山羊ENA中niRNA進(jìn)大規(guī)模鑒定,為闡明復(fù)雜而精確的miRNA-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)和ENA的發(fā)展過(guò)程的研究提供參考。利用熒光定量PCR技術(shù)對(duì)隨機(jī)挑選的9個(gè)miRNA進(jìn)行驗(yàn)證,結(jié)果表明9個(gè)：miRNA的表達(dá)趨勢(shì)與測(cè)序結(jié)果一致,說(shuō)明本次構(gòu)建的miRNA文庫(kù)獲得的測(cè)序數(shù)據(jù)可靠。chi-mir-133a、chi-mir-145-5p、mchi-mir-146a/200a可能作用于靶基因BRAF而通過(guò)對(duì)MAPK信號(hào)通路、PI3K-Akt信號(hào)通路、Ras信號(hào)通路,影響細(xì)胞的正常分裂周期,促進(jìn)了細(xì)胞的增殖,對(duì)ENA的發(fā)生起到了促進(jìn)作用。chi-mir-874-3p作用于靶標(biāo)VEGFA、chi-mir-148a-3p作用于靶標(biāo)TGF-β-RAP1,通過(guò)Pathways in cancer使得腫瘤細(xì)胞逃脫了TGF-β的抑制生長(zhǎng)作用,對(duì)ENA的發(fā)生、發(fā)展創(chuàng)造了條件,低表達(dá)的金屬蛋白酶和TGF-β在ENA的浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移中發(fā)揮了抑制作用。
【學(xué)位授予單位】：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S852.65
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本文編號(hào)：1330906