本文關(guān)鍵詞：ENTV和enENTV全基因組分析及ENA組織miRNA差異表達分析　出處：《四川農(nóng)業(yè)大學(xué)》2016年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：羊地方性鼻內(nèi)腺瘤(Enzootic Nasal Adenocarcinoma,ENA)又稱羊地方性鼻內(nèi)腫瘤(enzootic nasal Tumor,ENT)或山羊傳染性鼻內(nèi)腺癌,是由地方性鼻內(nèi)腫瘤病毒(Enzootic Nasal Tumor Virus of Goats,ENTV-2,Enzootic Nasal Tumor Virus of Sheep, ENTV-1)引起的一種慢性、進行性、接觸性傳染病,除澳大利亞和新西蘭外,該病呈世界性分布。臨床表現(xiàn)為食欲減退,極度消瘦,呼吸困難,鼻漏,出現(xiàn)鼻內(nèi)單側(cè)或雙側(cè)性增生物。該病發(fā)病率為5%-15%不等,一旦出現(xiàn)臨床癥狀,幾乎都以死亡告終。迄今為止該病沒有有效的方法進行早期診斷,一旦出現(xiàn)臨床癥狀就只能淘汰,也不能區(qū)分潛伏感染的羊只,導(dǎo)致疾病在整個羊群中散布,嚴(yán)重地威脅羊群的安全。至今,還未能成功建立ENTV的體外培養(yǎng)體系,使得研究該病毒的致瘤機制和免疫特性遇到了阻礙。本研究對ENTV-2及其對應(yīng)的內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒進行了全基因組測序,并進行了比對分析,分析了ENTV-2在病毒基因?qū)用娴闹铝鰴C制及鑒別內(nèi)外源ENTV-2的靶基因位點；通過對ENA腫瘤組織及癌旁組織進行高通量測序,建立了miRNA文庫,分析miRNA在山羊鼻腫瘤組織和癌旁組織中的表達差異,利用生物信息學(xué)軟件分析差異性表達miRNA的靶標(biāo)及相應(yīng)的生物學(xué)功能,分析miRNA在腫瘤形成中的作用,為進一步研究miRNA在ENA中的作用和機制提供理論和實驗依據(jù),在表觀遺傳層面研究ENTV-2的致瘤機制。1.山羊致病性鼻內(nèi)腺瘤病毒全基因組序列測定及分析通過分段RT-PCR方法從6例ENA山羊鼻內(nèi)腫瘤組織中擴增出6條ENTV-2全基因序列。ENTV-2 CHN6全長7500nt, ENTV-2 CHN7全長7501nt,ENTV-2 CHN8全長7501nt,ENTV-2 CHN9全長7503nt,ENTV-2 CHN10全長7500nt,ENTV-2 CHN11全長7499nt。將所得序列與GenBank中收錄的ENTV-2和ENTV-SC進行全基因比對,6個全基因組序列與ENTV-2的同源性均高于87%,與ENTV-SC的同源性均高于91%,具有較高的同源性,并且具有ENTV的gag和env基因的特征區(qū)域。經(jīng)過比對,發(fā)現(xiàn)ENTV-2和ENTV-1的基因組的突變區(qū)域主要集中在LTR的U5、U3區(qū)域,gag和env區(qū)域。ENTV-2與JSRV的基因組同源性約為84-89%,ENTV-1與比對的JSRV的基因組同源性為88.4-89.6%。ENTV-1與ENTV-2和JSRV的同源性比較接近。突變區(qū)主要集中在170bp以前和7400bp以后,即突變區(qū)主要集中在U5區(qū)、U3區(qū)和env基因末端。6株病毒株ENTV-2 CHN6-ENTV-2 CHN11的核苷酸突變以點突變?yōu)橹?只有LTR區(qū)有2bp的插入突變和2bp的缺失突變,編碼區(qū)的突變均為點突變,但突變并未引起編碼蛋白的結(jié)構(gòu)域和功能的改變。分析發(fā)現(xiàn),6株病毒株ENTV-2 CHN6-ENTV-2 CHN11的基因組存在點突變導(dǎo)致的變異,經(jīng)生物軟件分析突變尚未積累到影響病毒的結(jié)構(gòu)蛋白的空間構(gòu)型的改變。2.山羊內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒全基因組序列測定及分析通過分段PCR方法,從6例ENA山羊腎臟中擴增出6條enENTV。enENTV-CHN 1全長7889bp,enENTV-CHN2全長7890bp,enENTV-CHN3全長7897bp,enENTV-CHN4全長7891bp,enENTV-CHN5全長7928bp,enENTV-CHN6全長7921bp。將所得序列與GenBank中收錄的ENTV-2和ENTV-SC進行全基因比對,6個全基因組序列與ENTV-2的同源性均高于87%,與ENTV-SC的同源性均高于91%,具有較高的同源性,并且具有ENTV的gag和env基因的特征區(qū)域。enENTV與同源ENTV的核苷酸突變區(qū)主要集中在U3、U5、gag 3'端和env 3'端。通過全基因組同源性分析及序列分析發(fā)現(xiàn)enENTV遺傳比較穩(wěn)定,本次獲得enENTV-CHN1～6突變具有地域差異但與性別相關(guān)性不明顯。通過全基因組序列比對發(fā)現(xiàn)enENTV與ENTV-2相比具有5處連續(xù)突變,該區(qū)域可以作為區(qū)別鑒定enENTV與ENTV-2靶基因位點。3. ENTV-2 RT-PCR檢測方法的建立通過全基因組序列比對發(fā)現(xiàn)enENTV與ENTV-2相比在LTR U3區(qū)具有5處連續(xù)突變,7453bp處ENTV-2 CHN6-11有7bp插入突變,7828bp處3bp插入突變,針對ENTV-2相對enENTV的插入突變區(qū)設(shè)計了一對引物,對鑒別ENTV-2與enENTV的靶基因位點進行了驗證,建立ENTV的快速RT-PCR檢測方法。用該引物進行RT-PCR擴增,結(jié)果得到與試驗預(yù)計相符的391bp的特異性擴增條帶,與ENTV-2CHN6-11比對同源性均高于99%；此方法對健康羊鼻粘膜上皮、肺炎鏈球菌和支原體的擴增結(jié)果均為陰性,最低能檢測10 pg的RNA,有較好的穩(wěn)定性和重復(fù)性；對保存的100份病料進行檢測,并與臨床診斷結(jié)果進行比較,符合率100%。試驗表明全基因組序列比對發(fā)現(xiàn)的靶基因位點可以用于ENTV-2與enENTV的鑒別。4.山羊鼻內(nèi)腺瘤miRNA測序及表達差異分析應(yīng)用Illumina高通量測序技術(shù),對ENA山羊鼻內(nèi)腺瘤及癌旁組織進行miRNA測序,建立miRNA文庫,并對山羊鼻內(nèi)腺瘤組織和癌旁組織中miRNA的表達差異進行了分析。利用生物信息學(xué)軟件分析差異性表達miRNA的靶標(biāo)及相應(yīng)的生物學(xué)功能,進一步分析miRNA在腫瘤形成中的作用。本試驗發(fā)現(xiàn)406條已知miRNA,29條新miRNA,其中只在腫瘤組或?qū)φ战M表達的有34條(包含3條新miRNA),在腫瘤組和對照組中有116條miRNA有表達差異顯著,與對照組比較,其中54條miRNA在腫瘤組中表達下調(diào),60條miRNA在腫瘤組織中表達上調(diào),有2條只在對照組中表達。另外,在功能分析中,預(yù)測出顯著差異表達121 miRNA(116條顯著差異表達的miRNA和5條star序列)的靶標(biāo)、6172條、1792條顯著富集GO和97條顯著富集KEGG pathway、GO和KEGG pathway功能分析顯示大部分基因涉及到細胞分化、信號傳導(dǎo)等重要生命過程。本試驗第一次對山羊ENA中niRNA進大規(guī)模鑒定,為闡明復(fù)雜而精確的miRNA-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)和ENA的發(fā)展過程的研究提供參考。利用熒光定量PCR技術(shù)對隨機挑選的9個miRNA進行驗證,結(jié)果表明9個：miRNA的表達趨勢與測序結(jié)果一致,說明本次構(gòu)建的miRNA文庫獲得的測序數(shù)據(jù)可靠。chi-mir-133a、chi-mir-145-5p、mchi-mir-146a/200a可能作用于靶基因BRAF而通過對MAPK信號通路、PI3K-Akt信號通路、Ras信號通路,影響細胞的正常分裂周期,促進了細胞的增殖,對ENA的發(fā)生起到了促進作用。chi-mir-874-3p作用于靶標(biāo)VEGFA、chi-mir-148a-3p作用于靶標(biāo)TGF-β-RAP1,通過Pathways in cancer使得腫瘤細胞逃脫了TGF-β的抑制生長作用,對ENA的發(fā)生、發(fā)展創(chuàng)造了條件,低表達的金屬蛋白酶和TGF-β在ENA的浸潤轉(zhuǎn)移中發(fā)揮了抑制作用。
【學(xué)位授予單位】：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S852.65
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本文編號：1330906