本文關(guān)鍵詞：Tudor-SN蛋白參與細胞周期及細胞增殖調(diào)控的機制研究　出處：《天津醫(yī)科大學》2016年博士論文　論文類型：學位論文

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【摘要】：研究目的:細胞周期,是一個細胞從上一次分裂發(fā)生,到下一次分裂形成兩個子細胞的過程,它是生命不斷延續(xù)并更新的基礎(chǔ)。細胞通過每個周期的完成,來實現(xiàn)遺傳物質(zhì)的復制以及平均分配。細胞周期與細胞增殖、細胞分化之間存在著密切的聯(lián)系,它們彼此協(xié)調(diào),互相控制,共同在多種疾病(尤其是腫瘤)中發(fā)揮重要作用。細胞周期的調(diào)控涉及細胞周期蛋白(cyclins)的時序性表達和降解、細胞周期蛋白依賴性激酶(Cdks)和Cdk抑制蛋白(Cdk Is)活性的改變、以及一些相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控等。Tudor-SN蛋白是一個在多種動、植物細胞和組織中廣泛表達的保守的多功能蛋白,近些年不斷有研究發(fā)現(xiàn)Tudor-SN蛋白參與各種腫瘤的發(fā)生發(fā)展。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn),Tudor-SN蛋白可以促進He La細胞G1期至S期的周期進程;并且當細胞同步化于G1末期,再向S期釋放時,Tudor-SN蛋白的敲低可以阻止細胞向S期的釋放�？梢�,Tudor-SN蛋白是一個新發(fā)現(xiàn)的參與細胞周期調(diào)控的調(diào)節(jié)因子。但關(guān)于Tudor-SN蛋白調(diào)控細胞周期進程的詳細信號通路尚未揭示。課題組的相關(guān)研究還顯示,敲低Tudor-SN蛋白的表達可以抑制細胞的增殖活力,并且Tudor-SN蛋白的表達水平與細胞的增殖能力密切相關(guān):在增殖能力旺盛的細胞中表達水平高,在終末分化退出增殖周期的細胞中低表達或不表達,但調(diào)控的原因并不清楚。本課題為解決以上兩個問題,將分為兩部分展開研究,第一部分旨在研究Tudor-SN蛋白調(diào)控細胞周期G1期至S期進程的具體機制;第二部分將探討不同增殖能力的細胞或組織中Tudor-SN蛋白差異表達的調(diào)控機制。希望通過兩部分的研究,完善Tudor-SN蛋白參與細胞周期及細胞增殖調(diào)控的上游及下游信號通路,并為研究Tudor-SN蛋白通過調(diào)控細胞周期參與細胞的增殖、分化以及腫瘤的發(fā)生發(fā)展提供新的思路。研究方法:本課題的研究主要分為兩個部分。第一部分研究旨在明確Tudor-SN蛋白參與細胞周期G1期至S期周期進程調(diào)控的具體機制:1)利用免疫共沉淀(Co IP)技術(shù)結(jié)合細胞同步化技術(shù)明確不同周期時相Tudor-SN蛋白的表達水平及磷酸化修飾情況;2)利用Co IP及激酶活性抑制等方法明確不同周期時相磷酸化Tudor-SN蛋白的上游蛋白激酶;3)利用生物信息學預測、點突變技術(shù)、流式細胞周期檢測、雙熒光素酶分析技術(shù)等明確Tudor-SN蛋白參與細胞周期調(diào)控的磷酸化修飾位點;4)利用雙熒光素酶活性分析技術(shù)、WB及PCR實驗驗證Tudor-SN蛋白對S期基因轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控作用;5)利用Co IP、染色質(zhì)免疫共沉淀(Ch IP)等方法明確Tudor-SN蛋白調(diào)控S期基因表達的具體方式。第二部分探討不同增殖能力的細胞或組織中Tudor-SN蛋白差異表達的調(diào)控機制研究:1)利用WB、Realtime PCR、蔗糖密度梯度離心、多聚核糖體分布分析等檢測Tudor-SN蛋白在終末分化心肌細胞中低表達的調(diào)控機制;2)通過DBTSS數(shù)據(jù)庫明確Tudor-SN m RNA的轉(zhuǎn)錄起始位點,并分析其是否具有5’TOP序列;3)利用雙熒光素酶實驗結(jié)合抑制劑的使用明確PI3K/AKT/m TOR信號通路在腫瘤細胞系(He La)及心肌細胞系(H9C2)中對Tudor-SN蛋白及m RNA表達水平的調(diào)控;4)通過KEGG公共數(shù)據(jù)庫對前期心肌組織芯片的差異基因進行Pathway分析,篩選出與PI3K/AKT/m TOR信號傳導通路關(guān)系密切的基因,并利用Realtime PCR在出生1天及成年小鼠心肌組織中對芯片結(jié)果進行驗證;5)利用流式細胞周期檢測分析Tudor-SN蛋白對PI3K/AKT/m TOR信號通路調(diào)控細胞周期的影響。結(jié)果:1、Tudor-SN蛋白在不同細胞周期時相的絲/蘇氨酸磷酸化修飾水平不同,G1/S期及G2/M期Tudor-SN蛋白的絲/蘇氨酸磷酸化修飾水平高于其他期;而Cdk激酶是磷酸化Tudor-SN蛋白的上游激酶;Ser 426/Thr 429位點是Tudor-SN蛋白參與細胞周期調(diào)控的關(guān)鍵磷酸化位點;Tudor-SN蛋白通過募集組蛋白乙酰化酶(GCN5)至E2F-1轉(zhuǎn)錄復合體,增強E2F-1與下游基因(cyclin A,E2F-1)啟動子的結(jié)合能力,促進S期基因的轉(zhuǎn)錄活性,進而促成細胞G1/S期的轉(zhuǎn)換。2、Tudor-SN在退出細胞周期的終末分化心肌細胞中僅蛋白低表達,m RNA表達并未降低,調(diào)控發(fā)生在翻譯水平;Tudor-SN m RNA含有5’TOP序列,并且其5’TOP序列對基因表達的調(diào)控受PI3K/AKT/m TOR信號通路影響;Tudor-SN蛋白的表達受PI3K/AKT/m TOR/4EBP信號通路的調(diào)控;成熟小鼠心肌組織中PI3K/AKT/m TOR信號通路處于低活性狀態(tài);Tudor-SN蛋白影響PI3K/AKT/m TOR信號通路對細胞周期的調(diào)控。結(jié)論:1、Tudor-SN蛋白通過增強E2F-1下游基因的轉(zhuǎn)錄表達,促進細胞完成G1/S周期的轉(zhuǎn)換,在這個過程中,Cdk類激酶是Tudor-SN蛋白的上游激酶,Ser426/Thr 429是其參與周期調(diào)控的關(guān)鍵磷酸化位點。2、Tudor-SN是一個新發(fā)現(xiàn)的TOP m RNA,其在心肌細胞及腫瘤細胞中的表達水平受PI3K/AKT/m TOR/4EBP信號通路調(diào)控,同時作為PI3K/AKT/m TOR信號傳導通路的下游效應分子,Tudor-SN蛋白影響PI3K/AKT/m TOR信號傳導通路對細胞周期的調(diào)控。
【學位授予單位】：天津醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R329.2

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本文編號：1329506