本文關(guān)鍵詞：Tudor-SN蛋白參與細(xì)胞周期及細(xì)胞增殖調(diào)控的機(jī)制研究　出處：《天津醫(yī)科大學(xué)》2016年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：研究目的:細(xì)胞周期,是一個細(xì)胞從上一次分裂發(fā)生,到下一次分裂形成兩個子細(xì)胞的過程,它是生命不斷延續(xù)并更新的基礎(chǔ)。細(xì)胞通過每個周期的完成,來實(shí)現(xiàn)遺傳物質(zhì)的復(fù)制以及平均分配。細(xì)胞周期與細(xì)胞增殖、細(xì)胞分化之間存在著密切的聯(lián)系,它們彼此協(xié)調(diào),互相控制,共同在多種疾病(尤其是腫瘤)中發(fā)揮重要作用。細(xì)胞周期的調(diào)控涉及細(xì)胞周期蛋白(cyclins)的時序性表達(dá)和降解、細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶(Cdks)和Cdk抑制蛋白(Cdk Is)活性的改變、以及一些相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控等。Tudor-SN蛋白是一個在多種動、植物細(xì)胞和組織中廣泛表達(dá)的保守的多功能蛋白,近些年不斷有研究發(fā)現(xiàn)Tudor-SN蛋白參與各種腫瘤的發(fā)生發(fā)展。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn),Tudor-SN蛋白可以促進(jìn)He La細(xì)胞G1期至S期的周期進(jìn)程;并且當(dāng)細(xì)胞同步化于G1末期,再向S期釋放時,Tudor-SN蛋白的敲低可以阻止細(xì)胞向S期的釋放�？梢�,Tudor-SN蛋白是一個新發(fā)現(xiàn)的參與細(xì)胞周期調(diào)控的調(diào)節(jié)因子。但關(guān)于Tudor-SN蛋白調(diào)控細(xì)胞周期進(jìn)程的詳細(xì)信號通路尚未揭示。課題組的相關(guān)研究還顯示,敲低Tudor-SN蛋白的表達(dá)可以抑制細(xì)胞的增殖活力,并且Tudor-SN蛋白的表達(dá)水平與細(xì)胞的增殖能力密切相關(guān):在增殖能力旺盛的細(xì)胞中表達(dá)水平高,在終末分化退出增殖周期的細(xì)胞中低表達(dá)或不表達(dá),但調(diào)控的原因并不清楚。本課題為解決以上兩個問題,將分為兩部分展開研究,第一部分旨在研究Tudor-SN蛋白調(diào)控細(xì)胞周期G1期至S期進(jìn)程的具體機(jī)制;第二部分將探討不同增殖能力的細(xì)胞或組織中Tudor-SN蛋白差異表達(dá)的調(diào)控機(jī)制。希望通過兩部分的研究,完善Tudor-SN蛋白參與細(xì)胞周期及細(xì)胞增殖調(diào)控的上游及下游信號通路,并為研究Tudor-SN蛋白通過調(diào)控細(xì)胞周期參與細(xì)胞的增殖、分化以及腫瘤的發(fā)生發(fā)展提供新的思路。研究方法:本課題的研究主要分為兩個部分。第一部分研究旨在明確Tudor-SN蛋白參與細(xì)胞周期G1期至S期周期進(jìn)程調(diào)控的具體機(jī)制:1)利用免疫共沉淀(Co IP)技術(shù)結(jié)合細(xì)胞同步化技術(shù)明確不同周期時相Tudor-SN蛋白的表達(dá)水平及磷酸化修飾情況;2)利用Co IP及激酶活性抑制等方法明確不同周期時相磷酸化Tudor-SN蛋白的上游蛋白激酶;3)利用生物信息學(xué)預(yù)測、點(diǎn)突變技術(shù)、流式細(xì)胞周期檢測、雙熒光素酶分析技術(shù)等明確Tudor-SN蛋白參與細(xì)胞周期調(diào)控的磷酸化修飾位點(diǎn);4)利用雙熒光素酶活性分析技術(shù)、WB及PCR實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證Tudor-SN蛋白對S期基因轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控作用;5)利用Co IP、染色質(zhì)免疫共沉淀(Ch IP)等方法明確Tudor-SN蛋白調(diào)控S期基因表達(dá)的具體方式。第二部分探討不同增殖能力的細(xì)胞或組織中Tudor-SN蛋白差異表達(dá)的調(diào)控機(jī)制研究:1)利用WB、Realtime PCR、蔗糖密度梯度離心、多聚核糖體分布分析等檢測Tudor-SN蛋白在終末分化心肌細(xì)胞中低表達(dá)的調(diào)控機(jī)制;2)通過DBTSS數(shù)據(jù)庫明確Tudor-SN m RNA的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn),并分析其是否具有5’TOP序列;3)利用雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)結(jié)合抑制劑的使用明確PI3K/AKT/m TOR信號通路在腫瘤細(xì)胞系(He La)及心肌細(xì)胞系(H9C2)中對Tudor-SN蛋白及m RNA表達(dá)水平的調(diào)控;4)通過KEGG公共數(shù)據(jù)庫對前期心肌組織芯片的差異基因進(jìn)行Pathway分析,篩選出與PI3K/AKT/m TOR信號傳導(dǎo)通路關(guān)系密切的基因,并利用Realtime PCR在出生1天及成年小鼠心肌組織中對芯片結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證;5)利用流式細(xì)胞周期檢測分析Tudor-SN蛋白對PI3K/AKT/m TOR信號通路調(diào)控細(xì)胞周期的影響。結(jié)果:1、Tudor-SN蛋白在不同細(xì)胞周期時相的絲/蘇氨酸磷酸化修飾水平不同,G1/S期及G2/M期Tudor-SN蛋白的絲/蘇氨酸磷酸化修飾水平高于其他期;而Cdk激酶是磷酸化Tudor-SN蛋白的上游激酶;Ser 426/Thr 429位點(diǎn)是Tudor-SN蛋白參與細(xì)胞周期調(diào)控的關(guān)鍵磷酸化位點(diǎn);Tudor-SN蛋白通過募集組蛋白乙�；�(GCN5)至E2F-1轉(zhuǎn)錄復(fù)合體,增強(qiáng)E2F-1與下游基因(cyclin A,E2F-1)啟動子的結(jié)合能力,促進(jìn)S期基因的轉(zhuǎn)錄活性,進(jìn)而促成細(xì)胞G1/S期的轉(zhuǎn)換。2、Tudor-SN在退出細(xì)胞周期的終末分化心肌細(xì)胞中僅蛋白低表達(dá),m RNA表達(dá)并未降低,調(diào)控發(fā)生在翻譯水平;Tudor-SN m RNA含有5’TOP序列,并且其5’TOP序列對基因表達(dá)的調(diào)控受PI3K/AKT/m TOR信號通路影響;Tudor-SN蛋白的表達(dá)受PI3K/AKT/m TOR/4EBP信號通路的調(diào)控;成熟小鼠心肌組織中PI3K/AKT/m TOR信號通路處于低活性狀態(tài);Tudor-SN蛋白影響PI3K/AKT/m TOR信號通路對細(xì)胞周期的調(diào)控。結(jié)論:1、Tudor-SN蛋白通過增強(qiáng)E2F-1下游基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá),促進(jìn)細(xì)胞完成G1/S周期的轉(zhuǎn)換,在這個過程中,Cdk類激酶是Tudor-SN蛋白的上游激酶,Ser426/Thr 429是其參與周期調(diào)控的關(guān)鍵磷酸化位點(diǎn)。2、Tudor-SN是一個新發(fā)現(xiàn)的TOP m RNA,其在心肌細(xì)胞及腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)水平受PI3K/AKT/m TOR/4EBP信號通路調(diào)控,同時作為PI3K/AKT/m TOR信號傳導(dǎo)通路的下游效應(yīng)分子,Tudor-SN蛋白影響PI3K/AKT/m TOR信號傳導(dǎo)通路對細(xì)胞周期的調(diào)控。
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R329.2

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本文編號：1329506