發(fā)布時(shí)間：2017-12-24 08:34

  本文關(guān)鍵詞：植物微型反向重復(fù)轉(zhuǎn)座子數(shù)據(jù)庫（P-MITE）的構(gòu)建和煙草中TMV侵染后無癥狀表型控制基因的遺傳克隆　出處：《華中農(nóng)業(yè)大學(xué)》2016年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：本文研究?jī)?nèi)容包括三個(gè)部分,下面將分別從三個(gè)部分進(jìn)行論述:1植物中微型反向重復(fù)轉(zhuǎn)座子數(shù)據(jù)庫(P-MITE)的構(gòu)建微型反向重復(fù)轉(zhuǎn)座子(miniature inverted-repeat transposable element,MITE)是一類長(zhǎng)度較短的非自主型轉(zhuǎn)座子,具有DNA轉(zhuǎn)座子相似的結(jié)構(gòu),如末端反向重復(fù)(terminal inverted repeats,TIR)和正向序列重復(fù)(target site duplication,TSD)。與DNA轉(zhuǎn)座子不同,MITE在基因組中有很高的拷貝,傾向于插入基因內(nèi)或基因附近。MITE與基因的高度相關(guān)性可能預(yù)示著MITE在基因的調(diào)控中有著重要作用,可能是基因組進(jìn)化和物種分化的動(dòng)力之一。雖然關(guān)于MITE的研究有諸多報(bào)道,但由于缺乏各物種全基因組的MTIE信息和可以數(shù)據(jù)共享的平臺(tái),MITE的研究相對(duì)遲緩,特別是MITE的大規(guī)模組學(xué)分析。本研究中,我們利用軟件MITE Digger、MITE-Hunter和我們實(shí)驗(yàn)室自己開發(fā)的程序RSPB從41個(gè)已經(jīng)測(cè)序的植物基因組中從頭鑒定MITE。對(duì)于每一個(gè)MITE家族,我們至少手工鑒定了1條種子序列,來確保MITE鑒定的可靠性。包括之前在水稻中鑒定的MITE序列,我們一共得到了3,527個(gè)MITE家族,共計(jì)2,332,901條MITE序列。不同物種中MITE家族和拷貝數(shù)都不同,總體而言高等植物中具有更多數(shù)量的MITE。物種MITE數(shù)量的大小與物種基因組大小正相關(guān),表明MITE在基因組的進(jìn)化中起著一定的作用。我們從水稻、玉米、小米和馬鈴薯基因中共發(fā)現(xiàn)了10個(gè)具有潛在跳躍活性的MITE組,每組均含有至少20個(gè)相同的MITE拷貝。為了方便MITE的研究,我們構(gòu)建了MITE數(shù)據(jù)庫網(wǎng)站(P-MITE,網(wǎng)址為http://pmite.hzau.edu.cn/,),用以存儲(chǔ)本研究中產(chǎn)生的所有MITE數(shù)據(jù),并在P-MITE數(shù)據(jù)庫中提供了序列瀏覽、檢索、BLAST和下載等功能。P-MITE平臺(tái)的搭建將有利于促進(jìn)人們對(duì)MITE起源、MITE擴(kuò)增和MITE對(duì)基因的調(diào)控方式等方面的研究。2結(jié)合RNA-seq和BSA進(jìn)行基因遺傳定位的方法開發(fā)混合池分組分析法(Bulk segregant analysis,BSA)是一種可以快速找到與目標(biāo)基因連鎖的分子標(biāo)記的方法。將第二代測(cè)序和RNA-seq測(cè)序技術(shù)結(jié)合起來,可以快速找到與目的表型相關(guān)的基因組區(qū)域。目前已有多種方法可以用來進(jìn)行BSA RNA的分析,但這些方法的應(yīng)用需要被研究物種有較好的參考基因組。本研究中,我們開發(fā)了一個(gè)利用BSA RNA進(jìn)行數(shù)據(jù)分析的方法,snpMapper,并將該方法應(yīng)用到3個(gè)不同群體的BSA RNA數(shù)據(jù)分析中。結(jié)果表明,snpMapper均可以在3個(gè)數(shù)據(jù)集中找到與目標(biāo)基因相關(guān)的染色體區(qū)段,在沒有較好參考基因組的情況下,snpMapper也可以找到與目標(biāo)基因緊密連鎖的單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)(single nucleotide polymorphism,SNP)。因此,snpMapper是一個(gè)有效的BSA RNA-seq數(shù)據(jù)分析方法。3煙草中控制TMV侵染后產(chǎn)生無癥狀表型的基因的定位和克隆病毒在宿主體內(nèi)的有效復(fù)制需要宿主提供合適的因子。盡管在過去的研究中報(bào)道了諸多植物體內(nèi)參與病毒復(fù)制的宿主因子,但煙草中此類參與煙草花葉病毒(tobacco mosaic virus,TMV)復(fù)制的宿主因子沒有報(bào)道。本研究中,我們通過圖位克隆的方法在四倍體煙草中克隆到了2個(gè)參與煙草花葉病毒TMV-U1株系互作的宿主因子:NtTOM2A-Ntom和Nt TOM2A-Nsyl。遺傳分析發(fā)現(xiàn)這2個(gè)基因是分別位于2個(gè)亞基因組上的同源基因(homoeologous gene)。2個(gè)基因同時(shí)發(fā)生突變,使得TMV病毒在煙草中的積累量大幅度下降,從而導(dǎo)致了symptomless表型。熒光定量PCR(qRT-PCR)分析發(fā)現(xiàn),NtTOM2A在煙草不同組織中均有表達(dá),在根中的表達(dá)水平略高,在接種病毒前后表達(dá)水平?jīng)]有明顯的變化。我們通過標(biāo)記輔助選擇構(gòu)建了NtTOM2A-Nsyl的一個(gè)近等基因系,并對(duì)近等基因系及對(duì)照TI 203進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組分析。轉(zhuǎn)基因?qū)嶒?yàn)表明,來自11個(gè)物種的TOM2A均保留有協(xié)助TMV復(fù)制的功能。此外,我們還構(gòu)建了番茄中SlTOM2A的轉(zhuǎn)基因RNAi干涉系,鑒定了8株SlTOM2A mRNA水平被顯著抑制的T0代轉(zhuǎn)基因陽性苗。這些轉(zhuǎn)基因材料將用于分析通過降低SlTOM2A mRNA表達(dá)水平,是否可以降低TMV在宿主內(nèi)的積累量,從而培育抗TMV的番茄材料,為高抗育種提供新思路。
【學(xué)位授予單位】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：Q943.2;S432.41
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本文編號(hào)：1327619