本文關(guān)鍵詞：人工靶向核酸酶活性鑒定及陽(yáng)性編輯細(xì)胞富集系統(tǒng)優(yōu)化研究　出處：《西北農(nóng)林科技大學(xué)》2016年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：基因組編輯技術(shù)在過去的三十年間已經(jīng)發(fā)生了巨大變化,從最開始的同源重組技術(shù)演變到核酸酶靶向切割產(chǎn)生雙鏈斷裂切口進(jìn)而高效改造基因組。人工靶向核酸酶技術(shù)已經(jīng)從鋅指核酸酶(ZFNs)跨過轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)物核酸酶(TALENs)進(jìn)而快速發(fā)展到成熟的第三代CRISPR/Cas9系統(tǒng),這些基因組編輯技術(shù)的發(fā)展對(duì)細(xì)胞水平基因改造、動(dòng)物個(gè)體水平基因功能研究及轉(zhuǎn)基因動(dòng)物生產(chǎn)和人類個(gè)體水平基因疾病治療都起到了巨大推動(dòng)作用。但是在整個(gè)基因編輯技術(shù)發(fā)展過程中,各種技術(shù)還是有著特定的局限,除了高特異性鋅指核酸酶的篩選復(fù)雜、TALENs的組裝繁瑣及CRISPR/Cas9對(duì)基因組PAM序列的高度依賴外,以上三種技術(shù)在基因組編輯效率方面始終存在著重重阻礙�；谠搯栴},本實(shí)驗(yàn)室從2011年以來(lái)就一直致力于開發(fā)用于酵母和哺乳動(dòng)物細(xì)胞水平核酸酶活性鑒定及提高基因組水平編輯效率的報(bào)告系統(tǒng),為準(zhǔn)確衡量及評(píng)估核酸酶活性、提高核酸酶基因組編輯效率提供了多個(gè)選擇。本研究中在酵母水平及哺乳動(dòng)物細(xì)胞水平都開發(fā)出了高靈敏度的核酸酶活性驗(yàn)證系統(tǒng)。首先在酵母細(xì)胞中構(gòu)建了基于Gal4 BD和Gal4 AD的單鏈退火(SSA)報(bào)告系統(tǒng),并系統(tǒng)優(yōu)化了同源臂長(zhǎng)度對(duì)SSA修復(fù)效率的影響;在哺乳動(dòng)物細(xì)胞水平,通過比較核酸酶產(chǎn)生DNA雙鏈斷裂(DSB)后非同源末端連接(NHEJ)和單鏈退火修復(fù)效率的差異,開發(fā)出了高效的SSA-RPG核酸酶活性檢測(cè)及基因組編輯陽(yáng)性細(xì)胞富集系統(tǒng);同時(shí)也比較并優(yōu)化各個(gè)核酸酶平臺(tái),為將來(lái)挑選高效的核酸酶提供了有益參考。本文的主要研究結(jié)果如下:1.建立了基于酵母Gal4 BD-AD的單鏈退火(SSA)報(bào)告系統(tǒng),當(dāng)核酸酶切割兩條同源臂間的識(shí)別序列時(shí)會(huì)產(chǎn)生雙鏈斷裂切口,進(jìn)而引發(fā)SSA重組,從而與轉(zhuǎn)化效率組進(jìn)行比較而得到核酸酶的切割效率。為了有效降低報(bào)告載體自發(fā)重組引起的假陽(yáng)性,構(gòu)建了同源臂長(zhǎng)度從20 bp到164 bp以10 bp遞增的15個(gè)同源臂長(zhǎng)度的一系列報(bào)告載體。在單獨(dú)轉(zhuǎn)化報(bào)告載體的情況下,通過在營(yíng)養(yǎng)缺陷型培養(yǎng)基中計(jì)數(shù)陽(yáng)性克隆的數(shù)目,發(fā)現(xiàn)自發(fā)同源重組效率隨同源臂長(zhǎng)度的增加逐漸提高,且20 bp是報(bào)告載體自發(fā)重組所需的最短長(zhǎng)度;當(dāng)該報(bào)告載體與ZFNs同時(shí)轉(zhuǎn)化到酵母中時(shí),DSBs介導(dǎo)的同源重組效率也隨著同源臂長(zhǎng)度的增加而不斷提高,且30 bp長(zhǎng)度的同源臂可以引起高效率的同源重組,用來(lái)快速衡量核酸酶在酵母水平的切割活性。2.構(gòu)建了哺乳動(dòng)物細(xì)胞水平的核酸酶活性鑒定及陽(yáng)性細(xì)胞富集系統(tǒng)。通過將藥物篩選基因嘌呤霉素(puromycin)和兩種熒光素酶基因(DsRed和eGFP)整合運(yùn)用,構(gòu)建了DsRed-Puromycin-eGFP(RPG)報(bào)告系統(tǒng),DsRed紅色熒光蛋白的表達(dá)由獨(dú)立的啟動(dòng)子控制,用于衡量載體的細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率,puromycin和eGFP由剪切肽T2A融合在一起表達(dá),通過在puromycin基因前面和中間引入核酸酶識(shí)別序列打斷開放閱讀框,分別構(gòu)建了基于NHEJ和SSA兩種修復(fù)機(jī)制的報(bào)告系統(tǒng),分別命名為NHEJ-RPG和SSA-RPG報(bào)告系統(tǒng),當(dāng)核酸酶識(shí)別靶向序列并切割后,兩種系統(tǒng)分別通過NHEJ和SSA修復(fù)后引起puromycin和eGFP基因的表達(dá),進(jìn)而可以通過細(xì)胞流式分選(FACS)和藥物篩選來(lái)檢測(cè)核酸酶活性。本研究系統(tǒng)比較了核酸酶切割產(chǎn)生粘性末端和平末端的情況下NHEJ和SSA修復(fù)效率的差異,發(fā)現(xiàn)當(dāng)同源臂長(zhǎng)度大于等于100 bp時(shí)SSA的修復(fù)效率要高于NHEJ,且SSA修復(fù)的效率在同源臂長(zhǎng)度達(dá)到200 bp時(shí)開始穩(wěn)定在一定水平并不再顯著提高;且篩選后的細(xì)胞中基因組被編輯的效率與未篩選組相比提高6.3到34.8倍。3.為了提高核酸酶的活性,本研究通過位點(diǎn)特異性突變的方法構(gòu)建了突變型FokI,通過與鋅指蛋白融合保證了ZFNs的高活性并降低脫靶效率。綜上所述,本研究在酵母和哺乳動(dòng)物細(xì)胞水平都優(yōu)化構(gòu)建了一套簡(jiǎn)潔高效的核酸酶活性驗(yàn)證系統(tǒng),且該系統(tǒng)可用于篩選富集基因組編輯陽(yáng)性細(xì)胞,為將來(lái)基因組編輯技術(shù)的廣泛應(yīng)用鑒定了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ),進(jìn)而為使用靶向核酸酶技術(shù)對(duì)動(dòng)物進(jìn)行遺傳改造及育種研究奠定基礎(chǔ)。
【學(xué)位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：Q78

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本文編號(hào)：1324843