本文關(guān)鍵詞：TLR3調(diào)控新城疫病毒復制及細胞自噬的分子機制研究　出處：《揚州大學》2016年博士論文　論文類型：學位論文

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【摘要】：新城疫病毒(Newcastle disease virus, NDV)可以引起禽類的呼吸道疾病和死亡,給養(yǎng)禽業(yè)造成巨大的經(jīng)濟損失。NDV也能在人類腫瘤細胞中復制并破壞腫瘤細胞,因此作為一種溶瘤病毒被廣泛關(guān)注。近年來,病毒感染誘導的天然免疫機制逐漸成為研究熱點。Toll樣受體(toll-like receptors, TLRs)是新發(fā)現(xiàn)的一類細胞表面受體,其中的TLR3能夠識別病毒相關(guān)的dsRNA或dsRNA模擬物poly (I:C),在抗病毒天然免疫中發(fā)揮重要作用。目前,關(guān)于NDV誘導的TLR3信號通路及其對病毒復制的影響還沒有相關(guān)報道,激活的TLR3信號通路與細胞自噬之間是否具有聯(lián)系也不清楚。為了探究這些問題,我們開展了以下的研究：1.NDV感染與TLR3信號通路的激活用NDV Herts/33強毒株感染HeLa細胞系,以Western-blot和免疫熒光方法鑒定被感染細胞的TLR3變化。發(fā)現(xiàn)Herts/33強毒株感染能夠顯著提高TLR3的水平,在感染后12-24h最為明顯。使用dsRNA特異性抗體進行染色,發(fā)現(xiàn)NDV復制過程中能夠產(chǎn)生dsRNA,并激活TLR3信號通路；而紫外滅活的NDV不能激活該通路。采用NDV La Sota弱毒株進行了相同的實驗,所得到的結(jié)果與Herts/33強毒株相同。由此可見,NDV在感染細胞內(nèi)復制過程中產(chǎn)生的dsRNA能夠被TLR3識別并將其活化。2.TLR3信號通路與NDV復制的關(guān)系構(gòu)建人TLR3 (hTLR3)的真核表達質(zhì)粒,轉(zhuǎn)染HeLa細胞系后檢測過表達TLR3對NDV感染的影響。hTLR3過表達能夠顯著抑制病毒蛋白的轉(zhuǎn)錄和翻譯,減少細胞上清中的病毒滴度。將TLR3干擾RNA (siRNA)轉(zhuǎn)染HeLa細胞系后,TLR3的表達受到抑制,病毒蛋白的轉(zhuǎn)錄和翻譯水平上調(diào),病毒滴度增加。以real-time PCR檢測過表達TLR3后對干擾素和炎性因子產(chǎn)生的影響,IFN-β、IL-6、 IL-8和IFIT1 mRNA水平與對照組發(fā)生顯著變化。使用熒光素酶報告基因的方法檢測了轉(zhuǎn)染TLR3的細胞在感染NDV以后IFN-β、NF-κB啟動子活性,兩個啟動子的活性顯著增強。上述結(jié)果表明,TLR3在NDV感染中通過誘導干擾素的釋放和炎癥因子的產(chǎn)生發(fā)揮其抗病毒作用。3.抗NDV感染天然免疫中TLR3和RIG-I信號通路的關(guān)系評價了TLR3和視黃酸誘導基因蛋白-I(retinoic acid-inducible gene 1, RIG-I)信號通路在抗NDV感染中作用。將TLR3 siRNA、RIG-I siRNA、TLR3 siRNA+RIG-I siRNA分別轉(zhuǎn)染HeLa細胞,然后感染NDV,以real-time PCR的方法檢測IFN-β、IL-6、IL-8.IFIT1 mRNA水平的變化。發(fā)現(xiàn)單獨干擾TLR3的細胞中炎癥因子IL-6、IL-8 mRNA表達的水平低于單獨干擾RIG-I的細胞,而單獨干擾RIG-I的細胞中IFN-p mRNA表達水平低于單獨干擾TLR3的細胞。此外我們還通過雙熒光素酶報告基因的方法檢測了IFN-β、NF-κB啟動子活性的變化,同樣發(fā)現(xiàn)單獨干擾TLR3時NF-κB啟動子的活性低于單獨干擾RIG-I時,單獨干擾RIG-I時IFN-β啟動子的活性低于單獨干擾TLR3。綜上所述,兩種天然免疫的模式識別受體TLR3和RIG-I對下游干擾素和炎性因子的調(diào)節(jié)方式是不同的,兩者共同參與了NDV介導天然免疫反應。4.TLR3信號-通路激活與細胞自噬的關(guān)系用TLR3配體poly (I:C)處理A549細胞系,轉(zhuǎn)染GFP-LC3質(zhì)粒12-24 h后,GFP-LC3在細胞中呈現(xiàn)顯著的點狀分布;Western-blot顯示細胞內(nèi)的LC3-I向LC3-Ⅱ的轉(zhuǎn)化。同時,用poly(I:C)處理HeLa田胞系,也得到了相同的結(jié)果。說明TLR3激活后可以引起自噬。為了探究TLR3激活后引起的白噬是否為完整的自噬,我們用poly(I:C)刺激后對p62的降解進行了檢測,使用溶酶體抑制劑處理后western-blot檢測LC3-II的turnover,并且通過熒光觀察了GFP-LC3與LAMP1的共定位。綜上所述,poly (I:C)刺激后能夠引起細胞自噬,并且產(chǎn)生完整的自噬流。5.TLR3信號通路激活后誘導細胞自噬的機制通過免疫熒光的方法,觀察了TLR3及下游蛋白與Beclin-1的共定位。通過免疫共沉淀的方法,對TLR3及下游接頭蛋白與自噬相關(guān)蛋白進行互作研究。結(jié)果顯示,TLR3信號通路激活后,下游接頭蛋白TRIF與Beclin-1能夠發(fā)生部分共定位,并且發(fā)生相互作用,互作的區(qū)域在TRIF的TIR結(jié)合域和Beclin的BH3功能域。自噬未激活時,Beclin-1與B淋巴細胞瘤-2基因(B-cell lymphoma-2, Bcl-2)結(jié)合。綜上所述,TLR3信號通路激活后,下游接頭蛋白TRIF與Beclin-1相互作用,競爭性地抑制Bcl-2與Beclin-1結(jié)合,正向調(diào)控細胞白噬的過程。6.NDV病毒蛋白NP、P通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激誘導細胞自噬分別構(gòu)建了NDV各結(jié)構(gòu)蛋白的真核表達質(zhì)粒并轉(zhuǎn)染A549細胞系,以Western-blot和熒光試驗鑒定細胞自噬的產(chǎn)生以及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)的改變。結(jié)果顯示,NDV NP和P轉(zhuǎn)染細胞后能夠引起細胞自噬以及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激。此外NP和P還能夠激活非折疊蛋白通路(unfolded protein response, UPR)中的PERK和ATF6通路,而XBP1通路不被激活。將PERK和ATF6干擾后能夠抑制NDV誘導的自噬,降低NDV的復制水平。結(jié)論：本研究證明了TLR3信號通路在NDV感染細胞后可以被激活,TLR3通過促進下游細胞因子和干擾素的釋放發(fā)揮抗病毒作用；證實Beclin-1能與TLR3信號通路中的接頭蛋白TRIF互作,促進自噬的發(fā)生；發(fā)現(xiàn)NDV的NP和P蛋白能夠通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激相關(guān)的非折疊蛋白通路調(diào)控細胞自噬。
【學位授予單位】：揚州大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：S852.65

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本文編號：1318092