本文關(guān)鍵詞：馬鈴薯光誘導(dǎo)糖苷生物堿代謝相關(guān)miRNAs的鑒定與功能分析　出處：《甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)》2017年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：糖苷生物堿(steroidal glycoalkaloids,SGAs)是茄科植物(Solonum)和某些百合科(Liliaceae)植物中存在的一類次生代謝物,具有抑制病原微生物侵襲、拒避昆蟲采食、抗?jié)B透脅迫和化感效應(yīng),但馬鈴薯(Solonum tuberosum L.)塊莖中SGAs含量較多時(shí)會(huì)影響到食用風(fēng)味和安全性。因此,培育葉片中SGAs含量高而塊莖中含量低的品種(系),對(duì)于提高馬鈴薯的抗逆性并滿足食用安全性至關(guān)重要。馬鈴薯SGAs的合成是一個(gè)復(fù)雜的代謝網(wǎng)絡(luò)體系,相關(guān)酶基因呈共表達(dá)趨勢(shì),且在染色體上成簇分布,但目前對(duì)SGAs合成代謝相關(guān)miRNA的調(diào)控機(jī)制尚不清楚。鑒于紅光誘導(dǎo)可以顯著地提高SGAs合成積累,本研究以紅光誘導(dǎo)/暗處理的馬鈴薯普通栽培種和野生種二倍體種恰柯薯(Solanum chacoense)為材料,進(jìn)行小RNA、轉(zhuǎn)錄組和降解組測(cè)序,分析光誘導(dǎo)下的miRNAs及作用靶標(biāo),確定涉及SGAs代謝途徑的miRNAs,并通過(guò)綠色組織過(guò)表達(dá)重要miRNA,以鑒定其對(duì)SGAs的調(diào)控作用。主要研究結(jié)果如下:1.在馬鈴薯普通栽培種(S.tuberosum,2n=4X=48)中,共鑒定出277個(gè)已知miRNAs和120個(gè)新miRNAs;紅光誘導(dǎo)下,分別有31個(gè)(葉片)和48個(gè)(塊莖)miRNAs發(fā)生差異化的表達(dá)。轉(zhuǎn)錄組分析表明,在葉片和塊莖中,分別有1353個(gè)和1841個(gè)DEGs上調(diào),有1595個(gè)和897個(gè)DEGs下調(diào)。q RT-PCR檢測(cè)表明,小RNA高通量測(cè)序和轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)良好。2.在塊莖中光敏感型基因GO功能富集表明,生物過(guò)程涉及到次生代謝、雜環(huán)化合物的生物合成、四吡咯的代謝、葉綠素II和倍半萜類物質(zhì)的合成。Mapman功能分析表明,在葉片和塊莖中涉及主要碳水化合物代謝的基因表達(dá)量顯著下降,而涉及次生代謝的基因表達(dá)量明顯上調(diào),特別是催化SGAs合成代謝(甲瓦龍酸/類異戊二烯代謝途徑)第一階段的相關(guān)酶基因明顯增多和上調(diào)。葉片和塊莖中與生物堿代謝相關(guān)的ORCA和b HLH轉(zhuǎn)錄因子明顯上調(diào);兩類次生代謝相關(guān)的酶家族(CYP450酶、UDP-糖基轉(zhuǎn)移酶)成員在葉片和塊莖中差異化表達(dá)明顯。3.miRNAs-m RNAs整合分析表明,在葉片和塊莖中分別有41對(duì)和73對(duì)負(fù)向調(diào)節(jié)的miRNA/m RNA受紅光調(diào)節(jié)。其中,葉片中靶基因生物功能富集涉及葡聚糖的分解代謝、茉莉酸介導(dǎo)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和UMP補(bǔ)救合成;塊莖靶基因則涉及碳水化合物的代謝、NAD(P)H脫氫酶復(fù)合物的組裝、糖介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑和非編碼RNA的加工。整合分析表明,葉片miRNAs可靶向生物堿合成的b ZIP和b HLH轉(zhuǎn)錄因子,而上調(diào)的miR482b-3p可靶向uk激酶(能增加SGT2底物—配糖基供體UDP-葡萄糖);miR479則靶向糖苷生物堿合成的CYP450酶(CYP71D7)。4.恰柯薯(S.chacoense,2n=2X=24)是一SGAs含量高,能分離出抗蟲、抗病和抗逆基因的二倍體野生種。對(duì)紅光誘導(dǎo)下的塊莖sRNA高通量測(cè)序,共鑒定出Group 1的187個(gè)已知miRNAs和163個(gè)p5/p3 miRNAs,Group 2的204個(gè)已知miRNAs和220個(gè)p5/p3 miRNAs;共有337個(gè)新的miRNAs。其中,有24個(gè)高度保守miRNA家族,最大的是miR156。k-means聚類結(jié)果表明,恰柯薯光誘導(dǎo)下的miRNAs可劃分為9個(gè)類群(k1-k9),共呈現(xiàn)出持續(xù)上調(diào)(k2,k3,k4,k5)、持續(xù)下調(diào)(k1,k8,k9)、早期上調(diào)(k6)和早期下調(diào)(k7)四種表達(dá)模式,表明光可以動(dòng)態(tài)調(diào)控特定miRNAs,這類miRNAs則涉及多種生物學(xué)功能和代謝過(guò)程。5.降解組測(cè)序共檢測(cè)到恰柯薯miRNAs的1319條特有轉(zhuǎn)錄本。靶基因GO功能富集表明,在紅光誘導(dǎo)下,更多的miRNAs靶基因的GO功能被富集到TD24(紅光持續(xù)照射24 h)和TD72(紅光持續(xù)照射72 h)降解組文庫(kù);在TD24文庫(kù)中,miRNAs生物功能主要富集到細(xì)胞凋亡、雙信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)、防衛(wèi)反應(yīng)和染色質(zhì)重塑;而在TD72文庫(kù)中,miRNAs則富集到細(xì)胞凋亡、鉀離子轉(zhuǎn)運(yùn)、核黃素的生物合成過(guò)程和甾類化合物的代謝。6.sRNA與降解組測(cè)序聯(lián)合分析表明,光敏感型miRNAs可操縱與逆境脅迫相關(guān)的MYB4轉(zhuǎn)錄因子、熱休克蛋白(HSPs)及與ROS調(diào)節(jié)有關(guān)的EBF1/EBF2基因表達(dá)量,以實(shí)現(xiàn)對(duì)逆境的交叉適應(yīng)性。此外,光敏感型miRNAs可參與植物初生及次生代謝調(diào)控。其中,miR390和miR8175異構(gòu)體能靶向調(diào)控四吡咯類物質(zhì)合成的CPO I氧化酶和CHLP還原酶;miR8033異構(gòu)體能靶向調(diào)控黃酮類物質(zhì)合成的MYB4轉(zhuǎn)錄因子。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),光敏感型miRNAs能調(diào)控SGAs合成相關(guān)基因。其中,athmiR8175/gma-6300異構(gòu)體能剪切AMPK激酶,進(jìn)而磷酸化SGAs代謝相關(guān)的HMG-Co A還原酶;miR156-SPLs調(diào)控元件則能調(diào)控倍半萜類物質(zhì)的生物合成;miR482則靶向與甾醇類物質(zhì)代謝相關(guān)基因3-β羥甾類脫氫酶/異構(gòu)酶。此外,zma-MIR2275cp5_2ss14TA17AC和PC-3p-11646_92則能靶向與糖苷生物堿代謝相關(guān)的Cytochrome P450和CYP72A58基因。7.以p RS300的衍生載體p RSA-4為基礎(chǔ),構(gòu)建了35S啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的植物表達(dá)載體p CE35s-miR408和多順?lè)醋颖磉_(dá)載體p CE35s-dmiR408;并構(gòu)建了rbc S啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的植物表達(dá)載體p CEr-miR408和多順?lè)醋颖磉_(dá)載體p CEr-dmiR408。用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法對(duì)隴薯3號(hào)、隴薯6號(hào)和費(fèi)烏瑞它進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化,通過(guò)草甘膦篩選得到p CEr-miR408轉(zhuǎn)化再生植株27個(gè),p CEr-dmiR408轉(zhuǎn)化再生植株16個(gè),采用PCR分別鑒定出18株和13株陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因植株。q RT-PCR分析表明,p CEr-miR408和p CEr-dmiR408轉(zhuǎn)化陽(yáng)性植株的光合組織中miR408的表達(dá)量較以野生型對(duì)照(隴薯6號(hào))明顯提高,而靶基因VS1的表達(dá)量明顯降低,這表明miR408與VS1基因的表達(dá)呈相反趨勢(shì),但對(duì)于轉(zhuǎn)化陽(yáng)性植株光合組織中的SGAs含量仍需進(jìn)行深入的驗(yàn)證和分析。
【學(xué)位授予單位】：甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：S532;Q943.2

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：1317128