本文關(guān)鍵詞：馬鈴薯光誘導糖苷生物堿代謝相關(guān)miRNAs的鑒定與功能分析　出處：《甘肅農(nóng)業(yè)大學》2017年博士論文　論文類型：學位論文

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【摘要】：糖苷生物堿(steroidal glycoalkaloids,SGAs)是茄科植物(Solonum)和某些百合科(Liliaceae)植物中存在的一類次生代謝物,具有抑制病原微生物侵襲、拒避昆蟲采食、抗?jié)B透脅迫和化感效應,但馬鈴薯(Solonum tuberosum L.)塊莖中SGAs含量較多時會影響到食用風味和安全性。因此,培育葉片中SGAs含量高而塊莖中含量低的品種(系),對于提高馬鈴薯的抗逆性并滿足食用安全性至關(guān)重要。馬鈴薯SGAs的合成是一個復雜的代謝網(wǎng)絡體系,相關(guān)酶基因呈共表達趨勢,且在染色體上成簇分布,但目前對SGAs合成代謝相關(guān)miRNA的調(diào)控機制尚不清楚。鑒于紅光誘導可以顯著地提高SGAs合成積累,本研究以紅光誘導/暗處理的馬鈴薯普通栽培種和野生種二倍體種恰柯薯(Solanum chacoense)為材料,進行小RNA、轉(zhuǎn)錄組和降解組測序,分析光誘導下的miRNAs及作用靶標,確定涉及SGAs代謝途徑的miRNAs,并通過綠色組織過表達重要miRNA,以鑒定其對SGAs的調(diào)控作用。主要研究結(jié)果如下:1.在馬鈴薯普通栽培種(S.tuberosum,2n=4X=48)中,共鑒定出277個已知miRNAs和120個新miRNAs;紅光誘導下,分別有31個(葉片)和48個(塊莖)miRNAs發(fā)生差異化的表達。轉(zhuǎn)錄組分析表明,在葉片和塊莖中,分別有1353個和1841個DEGs上調(diào),有1595個和897個DEGs下調(diào)。q RT-PCR檢測表明,小RNA高通量測序和轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)良好。2.在塊莖中光敏感型基因GO功能富集表明,生物過程涉及到次生代謝、雜環(huán)化合物的生物合成、四吡咯的代謝、葉綠素II和倍半萜類物質(zhì)的合成。Mapman功能分析表明,在葉片和塊莖中涉及主要碳水化合物代謝的基因表達量顯著下降,而涉及次生代謝的基因表達量明顯上調(diào),特別是催化SGAs合成代謝(甲瓦龍酸/類異戊二烯代謝途徑)第一階段的相關(guān)酶基因明顯增多和上調(diào)。葉片和塊莖中與生物堿代謝相關(guān)的ORCA和b HLH轉(zhuǎn)錄因子明顯上調(diào);兩類次生代謝相關(guān)的酶家族(CYP450酶、UDP-糖基轉(zhuǎn)移酶)成員在葉片和塊莖中差異化表達明顯。3.miRNAs-m RNAs整合分析表明,在葉片和塊莖中分別有41對和73對負向調(diào)節(jié)的miRNA/m RNA受紅光調(diào)節(jié)。其中,葉片中靶基因生物功能富集涉及葡聚糖的分解代謝、茉莉酸介導信號轉(zhuǎn)導和UMP補救合成;塊莖靶基因則涉及碳水化合物的代謝、NAD(P)H脫氫酶復合物的組裝、糖介導的信號轉(zhuǎn)導途徑和非編碼RNA的加工。整合分析表明,葉片miRNAs可靶向生物堿合成的b ZIP和b HLH轉(zhuǎn)錄因子,而上調(diào)的miR482b-3p可靶向uk激酶(能增加SGT2底物—配糖基供體UDP-葡萄糖);miR479則靶向糖苷生物堿合成的CYP450酶(CYP71D7)。4.恰柯薯(S.chacoense,2n=2X=24)是一SGAs含量高,能分離出抗蟲、抗病和抗逆基因的二倍體野生種。對紅光誘導下的塊莖sRNA高通量測序,共鑒定出Group 1的187個已知miRNAs和163個p5/p3 miRNAs,Group 2的204個已知miRNAs和220個p5/p3 miRNAs;共有337個新的miRNAs。其中,有24個高度保守miRNA家族,最大的是miR156。k-means聚類結(jié)果表明,恰柯薯光誘導下的miRNAs可劃分為9個類群(k1-k9),共呈現(xiàn)出持續(xù)上調(diào)(k2,k3,k4,k5)、持續(xù)下調(diào)(k1,k8,k9)、早期上調(diào)(k6)和早期下調(diào)(k7)四種表達模式,表明光可以動態(tài)調(diào)控特定miRNAs,這類miRNAs則涉及多種生物學功能和代謝過程。5.降解組測序共檢測到恰柯薯miRNAs的1319條特有轉(zhuǎn)錄本。靶基因GO功能富集表明,在紅光誘導下,更多的miRNAs靶基因的GO功能被富集到TD24(紅光持續(xù)照射24 h)和TD72(紅光持續(xù)照射72 h)降解組文庫;在TD24文庫中,miRNAs生物功能主要富集到細胞凋亡、雙信號轉(zhuǎn)導系統(tǒng)、防衛(wèi)反應和染色質(zhì)重塑;而在TD72文庫中,miRNAs則富集到細胞凋亡、鉀離子轉(zhuǎn)運、核黃素的生物合成過程和甾類化合物的代謝。6.sRNA與降解組測序聯(lián)合分析表明,光敏感型miRNAs可操縱與逆境脅迫相關(guān)的MYB4轉(zhuǎn)錄因子、熱休克蛋白(HSPs)及與ROS調(diào)節(jié)有關(guān)的EBF1/EBF2基因表達量,以實現(xiàn)對逆境的交叉適應性。此外,光敏感型miRNAs可參與植物初生及次生代謝調(diào)控。其中,miR390和miR8175異構(gòu)體能靶向調(diào)控四吡咯類物質(zhì)合成的CPO I氧化酶和CHLP還原酶;miR8033異構(gòu)體能靶向調(diào)控黃酮類物質(zhì)合成的MYB4轉(zhuǎn)錄因子。進一步研究發(fā)現(xiàn),光敏感型miRNAs能調(diào)控SGAs合成相關(guān)基因。其中,athmiR8175/gma-6300異構(gòu)體能剪切AMPK激酶,進而磷酸化SGAs代謝相關(guān)的HMG-Co A還原酶;miR156-SPLs調(diào)控元件則能調(diào)控倍半萜類物質(zhì)的生物合成;miR482則靶向與甾醇類物質(zhì)代謝相關(guān)基因3-β羥甾類脫氫酶/異構(gòu)酶。此外,zma-MIR2275cp5_2ss14TA17AC和PC-3p-11646_92則能靶向與糖苷生物堿代謝相關(guān)的Cytochrome P450和CYP72A58基因。7.以p RS300的衍生載體p RSA-4為基礎(chǔ),構(gòu)建了35S啟動子驅(qū)動的植物表達載體p CE35s-miR408和多順反子表達載體p CE35s-dmiR408;并構(gòu)建了rbc S啟動子驅(qū)動的植物表達載體p CEr-miR408和多順反子表達載體p CEr-dmiR408。用農(nóng)桿菌介導法對隴薯3號、隴薯6號和費烏瑞它進行遺傳轉(zhuǎn)化,通過草甘膦篩選得到p CEr-miR408轉(zhuǎn)化再生植株27個,p CEr-dmiR408轉(zhuǎn)化再生植株16個,采用PCR分別鑒定出18株和13株陽性轉(zhuǎn)基因植株。q RT-PCR分析表明,p CEr-miR408和p CEr-dmiR408轉(zhuǎn)化陽性植株的光合組織中miR408的表達量較以野生型對照(隴薯6號)明顯提高,而靶基因VS1的表達量明顯降低,這表明miR408與VS1基因的表達呈相反趨勢,但對于轉(zhuǎn)化陽性植株光合組織中的SGAs含量仍需進行深入的驗證和分析。
【學位授予單位】：甘肅農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：S532;Q943.2

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前7條

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本文編號：1317128