本文關(guān)鍵詞：產(chǎn)腸毒素大腸桿菌（ETEC）F4菌毛特異性蛋白受體—豬源氨肽酶N的研究　出處：《揚(yáng)州大學(xué)》2016年博士論文　論文類(lèi)型：學(xué)位論文

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【摘要】：新生和斷奶仔豬腹瀉是全球范圍內(nèi)影響?zhàn)B豬業(yè)發(fā)展的最為普遍的胃腸道疾病,主要與產(chǎn)腸毒素大腸桿菌(ETEC) F4(或K88)在仔豬腸道內(nèi)的黏附、定植和感染有關(guān),該病原不僅能夠引發(fā)仔豬黃痢、白痢、水腫病和斷奶仔豬腹瀉等多種疾病,還易混合和繼發(fā)多種疾病感染。ETEC F4病原菌有ab、ac、ad三種血清型變異株,其中以F4ac最為常見(jiàn)。這三種血清型F4大腸桿菌在腸道細(xì)胞黏附力、黏附素faeG基因和致病性上具有一定的差異。研究發(fā)現(xiàn),ETEC F4能否特異性結(jié)合豬小腸黏膜上皮細(xì)胞,取決于豬小腸黏膜上有無(wú)相應(yīng)的受體,無(wú)F4受體的豬表現(xiàn)為抗性,不會(huì)感染F4大腸桿菌發(fā)��；而有受體的豬則表現(xiàn)為敏感,在感染F4大腸桿菌后發(fā)病。也就是說(shuō),F4ab、F4ac、F4ad大腸桿菌在宿主腸道內(nèi)的黏附、定植和感染取決于F4ab、F4ac、F4ad菌毛和小腸黏膜上特異性受體之間的互作。自1975年以來(lái),有關(guān)F4菌毛受體的相關(guān)基因和蛋白陸續(xù)被報(bào)道,但遺憾的是,選擇并鑒別真正的受體基因或候選蛋白仍然是研究的難點(diǎn),而對(duì)于已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的受體基因和蛋白,也仍然缺乏直接有效的方法和證據(jù)來(lái)進(jìn)行鑒別。近年來(lái),豬源氨肽酶N (APN)被報(bào)道稱(chēng)是一種新型的F4菌毛黏附受體,并在F4 ETEC細(xì)菌的內(nèi)化和機(jī)體免疫過(guò)程中發(fā)揮了重要的作用。因此,本研究選取APN蛋白作為研究對(duì)象,通過(guò)多種方法驗(yàn)證其作為ETEC F4的直接受體蛋白的可能性和可信度,并確定其功能結(jié)合域,從而獲得抗病育種的目的基因或靶標(biāo)蛋白,進(jìn)而探討F4+三種不同血清型變異株的感染致病機(jī)制和相關(guān)信號(hào)通路,為研發(fā)新型有效候選疫苗和培育抗病性優(yōu)勢(shì)豬種提供技術(shù)支撐,旨在從根本上減少或控制仔豬細(xì)菌性腹瀉的發(fā)生。由于黏液素4(MUC4)基因內(nèi)含子7的多態(tài)性變異位點(diǎn)與大多數(shù)ETEC F4的黏附表型相關(guān),本研究通過(guò)檢測(cè)MUC4基因內(nèi)含子7的多態(tài)性來(lái)對(duì)不同豬種的不同個(gè)體進(jìn)行初步分型,結(jié)合新鮮屠宰豬腸道的刷狀緣細(xì)胞的細(xì)菌黏附實(shí)驗(yàn)結(jié)果,確定實(shí)驗(yàn)樣本豬。提取豬空腸RNA后PCR獲得APN的全長(zhǎng)基因,體外表達(dá)、純化APN蛋白,免疫小鼠并制備相應(yīng)的多克隆抗體。利用Red同源重組的方法構(gòu)建F4+ETEC菌毛缺失株,同時(shí)構(gòu)建攜帶fae全操縱子表達(dá)的SE5000重組菌,并進(jìn)行了上述缺失株、重組菌及野生菌的體外黏附實(shí)驗(yàn)、黏附抑制實(shí)驗(yàn)。同時(shí),構(gòu)建能夠穩(wěn)定表達(dá)的APN過(guò)表達(dá)細(xì)胞系pEC129-APN IPEC-J2和APN沉默細(xì)胞系pcDNATM6.2-GW/miR-APN IPEC-J2,將表達(dá)出的蛋白與活體分離的APN蛋白進(jìn)行功能性對(duì)比,通過(guò)酶活性實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞免疫組化等確定原核表達(dá)、真核表達(dá)蛋白以及生物體內(nèi)APN蛋白的酶活性及其對(duì)于宿主細(xì)胞識(shí)別病原菌能力的影響。利用酵母雙雜交、Pull-down和Western blot等方法驗(yàn)證蛋白-蛋白之間的相互作用,為APN蛋白與菌毛蛋白的直接互作提供證據(jù)。同時(shí),探討APN蛋白對(duì)F4大腸桿菌體外黏附的影響,APN蛋白與F4菌毛蛋白互作的功能性結(jié)合域,比較APN蛋白與F4三種血清型互作的差異,并初步探究鋅離子依賴型蛋白APN在鋅離子作用條件下的作用機(jī)理和相關(guān)信號(hào)通路,主要研究?jī)?nèi)容分為以下6個(gè)部分：1.豬產(chǎn)腸毒素大腸桿菌F4受體的初步分型有研究表明,ETEC F4的受體基因可被精細(xì)定位于豬染色體SSC13q41區(qū)域,并與MUC4基因密切相關(guān)。根據(jù)MUC4基因內(nèi)含子7在限制性內(nèi)切酶Xba Ⅰ作用下所表現(xiàn)出的多態(tài)性,可以在基因水平上將所檢測(cè)的豬分為易感型純合子SS,易感型雜合子SR和抵抗型RR。本實(shí)驗(yàn)利用MUC4基因多態(tài)性的這一特性,對(duì)送檢豬的樣品進(jìn)行初步的分型檢測(cè),并結(jié)合新鮮屠宰豬腸道刷狀緣細(xì)胞的黏附表型結(jié)果篩選目的樣本,選取基因分型結(jié)果和細(xì)菌黏附實(shí)驗(yàn)結(jié)果相一致的對(duì)應(yīng)樣本,即代號(hào)長(zhǎng)白202和梅山2877對(duì)應(yīng)豬的樣品進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn),兩者分別為易感型純合子和易感型雜合子,且小腸刷狀緣細(xì)胞的細(xì)菌黏附實(shí)驗(yàn)結(jié)果均為強(qiáng)黏附型。2.豬源氨肽酶N基因的克隆和表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建為探討APN作為產(chǎn)腸毒素大腸桿菌F4受體蛋白的可能性,根據(jù)GenBank上豬APNmRNA序列設(shè)計(jì)合成特異性引物,從新鮮屠宰的梅山仔豬易感個(gè)體小腸組織中提取總RNA并反轉(zhuǎn)錄成cDNA第一鏈,RT-PCR擴(kuò)增豬APN全長(zhǎng)基因,并分別構(gòu)建真核表達(dá)和原核表達(dá)系統(tǒng)。重組質(zhì)粒測(cè)序和酶切結(jié)果顯示：APN基因已正確插入pcDNA3.1真核表達(dá)載體和pET-28a(+)原核表達(dá)載體,SDS-PAGE結(jié)果證明重組蛋白為包涵體,且純化產(chǎn)物在110 KDa處有單一明顯條帶。pcDNA3.1-APN和pET28a-APN雙系統(tǒng)的成功構(gòu)建以及APN蛋白的成功表達(dá),為進(jìn)一步研究和驗(yàn)證該蛋白作為豬F4菌毛受體候選蛋白的可能性奠定了基礎(chǔ)和平臺(tái)。3. FaeG介導(dǎo)豬源氨肽酶N與產(chǎn)腸毒素大腸桿菌ETEC F4+的黏附FaeG亞單位是菌毛主要的功能性亞基,該亞單位與糖蛋白或糖脂受體識(shí)別相關(guān),有助于病原菌附著到宿主細(xì)胞。本研究利用構(gòu)建所得的大腸桿菌F4+fae全操縱子基因表達(dá)的重組菌和△faeG缺失株探討APN與大腸桿菌F4+FaeG亞基之間的相互作用。結(jié)果顯示,純化后的APN蛋白能夠和F4+ETEC之間發(fā)生肉眼可見(jiàn)的凝集反應(yīng),證明該蛋白能夠識(shí)別并結(jié)合三種血清型的F4+菌毛,而△faeG缺失株與APN蛋白之間的凝集反應(yīng)明顯減弱。酵母雙雜交、pull-down等實(shí)驗(yàn)的陽(yáng)性結(jié)果也證明,FaeG亞單位蛋白與APN蛋白之間也能夠直接發(fā)生相互作用,這些結(jié)果證明FaeG是菌毛有效的直接黏附功能亞基,也是APN蛋白作用的靶點(diǎn)部位。4.豬氨肽酶N對(duì)產(chǎn)腸毒素大腸桿菌(ETEC) F4黏附力的影響有研究表明,APN能夠促進(jìn)小腸上皮細(xì)胞內(nèi)吞F4ac菌毛,誘導(dǎo)黏膜免疫的發(fā)生。前期研究中,我們發(fā)現(xiàn)APN蛋白與F4菌毛的主要亞單位FaeG蛋白間存在直接的相互作用。本研究中,利用篩選獲得的APN靜默穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系pcDNATN6.2-GW/miR-APN IPEC-J2/Caco-2和APN過(guò)表達(dá)穩(wěn)定細(xì)胞系pEC129-APN IPEC-J2/Caco-2進(jìn)行一系列的功能驗(yàn)證試驗(yàn),以未處理的IPEC-J2/Caco-2細(xì)胞作為對(duì)照,探討APN對(duì)大腸桿菌F4黏附力的影響。結(jié)果表明,與對(duì)照組細(xì)胞相比,RNAi干擾細(xì)胞系的APN表達(dá)量明顯降低,pEC129-APN細(xì)胞系的APN表達(dá)量則顯著高于上述兩個(gè)細(xì)胞系；而細(xì)胞對(duì)細(xì)菌的黏附能力則與細(xì)胞中APN的表達(dá)量變化呈正相關(guān)。5.豬源氨肽酶N功能結(jié)合域的研究在前期研究中,我們發(fā)現(xiàn),APN與F4菌毛的主要亞單位FaeG之間存在直接的蛋白互作,而APN表達(dá)量的高低能夠直接影響細(xì)胞對(duì)細(xì)菌的黏附。為了進(jìn)一步驗(yàn)證APN在F4菌毛與宿主細(xì)胞相互作用中發(fā)揮的功能,探究其作用機(jī)理,本實(shí)驗(yàn)利用重疊多肽陣列技術(shù)高通量篩查APN與F4ab、F4ac、F4ad菌毛FaeG亞單位的互作位點(diǎn),并結(jié)合Pull-down、 Western blot等試驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證,最終確定APN的功能結(jié)合域。比較APN蛋白與F4三種血清型FaeG蛋白的結(jié)合位點(diǎn),可知APN-FaeG的結(jié)合位點(diǎn)主要集中于F4ab FaeG蛋白的148-160、199-217位氨基酸(aa)殘基；F4ac FaeG蛋白的149-161、176-188、200-218位氨基酸(aa)殘基；F4ad FaeG蛋白的149-161、200-218位氨基酸(aa)殘基。6.豬源氨肽酶N作用機(jī)理的探究鋅離子(Zn2+)是豬生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中重要的微量金屬離子,Zn2+的缺乏常常會(huì)導(dǎo)致仔豬生長(zhǎng)發(fā)育不良,而適量的高鋅飼料不僅有利于仔豬的健康生長(zhǎng),還能明顯減少仔豬下痢。APN是一種鋅離子依賴型的膜結(jié)合外肽酶,具有鋅離子結(jié)合激活位點(diǎn)。前期研究表明,高濃度的Zn2+溶液能夠降低APN蛋白的生物學(xué)活性。為了探討APN蛋白與Zn2+之間的相關(guān)性,以及它們?cè)贔4大腸桿菌黏附、定植、誘發(fā)疾病過(guò)程中的作用機(jī)理,本實(shí)驗(yàn)針對(duì)與APN基因轉(zhuǎn)錄和體內(nèi)Zn2+濃度變化都密切相關(guān)的蛋白激酶MAPK信號(hào)通路,以及相關(guān)的細(xì)胞因子展開(kāi)了探索研究。研究發(fā)現(xiàn),在一定的濃度范圍內(nèi),Zn2+能夠減少F4大腸桿菌對(duì)細(xì)胞的黏附,還能夠?qū)?xì)胞內(nèi)ERK、p38、JNK蛋白的磷酸化以及相關(guān)細(xì)胞因子的表達(dá)產(chǎn)生影響。
【學(xué)位授予單位】：揚(yáng)州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：S852.61

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前1條

1 蔣雋,施啟順,柳小春,黃生強(qiáng),賀長(zhǎng)青;不同豬種腸毒素大腸桿菌(ETEC)F4受體微衛(wèi)星標(biāo)記遺傳差異性研究[J];遺傳;2004年02期

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本文編號(hào)：1316081