發(fā)布時間：2017-12-20 06:27

  本文關鍵詞：縮宮素對肥大細胞脫顆粒和DRG神經(jīng)元興奮性的影響及其機制研究　出處：《山東大學》2016年博士論文　論文類型：學位論文

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【摘要】：疼痛影響人們生活的各個方面,雖然現(xiàn)代醫(yī)學取得巨大進步,但是許多慢性痛仍然是醫(yī)學所面臨的重大挑戰(zhàn)。在消化系統(tǒng)中,內(nèi)臟慢性痛主要見于功能性腸病(例如,慢性特發(fā)性消化不良,功能性腹痛,腸易激綜合癥等),其中最常見于腸易激綜合癥(irritable bowel syndrome,IBS)。目前對內(nèi)臟痛的研究發(fā)現(xiàn),中樞和外周機制均起重要作用。中樞神經(jīng)系統(tǒng)中,腦腸軸機制越來越凸顯；在外周,免疫機制以及神經(jīng)-免疫關聯(lián)在內(nèi)臟痛發(fā)生中發(fā)揮重要的作用。縮宮素(oxytocin,OT)是由九個氨基酸組成的神經(jīng)肽,主要由下丘腦的室旁核和視上核合成。OT在臨床上主要用于引產(chǎn)、催產(chǎn)、產(chǎn)后出血以及促排乳。近些年研究表明,OT及縮宮素受體(oxytocin receptor,OTR)在腸道中表達,而且在腸道運動和感覺,腸道炎癥的調(diào)節(jié),腸粘膜結構功能的維持等方面發(fā)揮重要的作用。越來越多的研究證實,在外周器官應用OT(靜脈注射、腹腔注射、皮下注射以及結腸灌注),能顯著抑制內(nèi)臟痛的發(fā)生。深入研究OT對內(nèi)臟痛的作用及其機制,可為預防和治療內(nèi)臟痛提供新的方法和依據(jù)。本研究主要從免疫和神經(jīng)兩方面探討OT的外周鎮(zhèn)痛機制。第一部分：縮宮素對結腸高敏感大鼠肥大細胞脫顆粒的影響及其機制研究目的已有文獻報道,OT和OTR在腸道中表達,OT能顯著抑制內(nèi)臟痛及內(nèi)臟高敏感的發(fā)生。然而,機制尚不明確。研究發(fā)現(xiàn),IBS患者腹痛的嚴重程度及頻率與結腸神經(jīng)周圍的肥大細胞數(shù)目有關,而且肥大細胞激活通過脫顆粒并釋放炎性介質(zhì),增強腸神經(jīng)以及背根神經(jīng)節(jié)(dorsal root ganglion,DRG)神經(jīng)元的興奮性,從而導致內(nèi)臟高敏感。本研究的目的是探討OT對肥大細胞脫顆粒的作用及其機制,以期揭示OT抑制內(nèi)臟痛的外周免疫機制。方法通過免疫熒光實驗和蛋白免疫印跡(Western Blot)實驗,檢測OTR在肥大細胞的表達。給予大鼠結腸灌注三硝基苯磺酸(2,4,6-trinitrobenzene sulfonic acid, TNBS),來誘導結腸高敏感動物模型,采取結腸灌注OT的方法研究OT對結腸高敏感大鼠的作用。使用甲苯胺藍標記大鼠結腸組織切片中的肥大細胞,觀察肥大細胞的數(shù)目和脫顆粒情況。肥大細胞激活后釋放的組胺含量通過酶聯(lián)免疫吸附測定(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)試劑盒進行測定。運用全細胞膜片鉗技術記錄肥大細胞的膜離子流。通過鈣成像設備檢測肥大細胞內(nèi)鈣離子Ca2+的變化。結果1.0TR在肥大細胞上的表達免疫熒光實驗證實,OTR在人和大鼠結腸組織的肥大細胞上表達。潰瘍性結腸炎患者以及TNBS誘導的內(nèi)臟高敏感模型大鼠的結腸組織中OTR表達陽性的肥大細胞比例均顯著升高。OTR也表達于人肥大細胞株-1(human mast cell line-1,HMC-1)和小鼠肥大細胞瘤細胞株(mouse mastocytoma cell line,P815)。2.0T對肥大細胞脫顆粒的影響OT能顯著抑制TNBS誘導的結腸高敏感模型大鼠結腸肥大細胞脫顆粒。經(jīng)OT灌腸的TNBS模型大鼠結腸切片中脫顆粒肥大細胞的百分數(shù)(53.5%,38/71),顯著低于TNBS模型大鼠(81.9%,59/72)。3.0T對肥大細胞脫顆粒時釋放組胺的影響采用化合物48/80(compound 48/80,C48/80)誘導P815細胞脫顆粒,釋放組胺,10-6M OT預處理細胞后,C48/80誘導P815細胞釋放組胺的含量明顯降低。4.0T對肥大細胞內(nèi)向電流的影響用全細胞膜片鉗記錄的方法來測定OT對C48/80誘導HMC-1細胞和P815細胞產(chǎn)生內(nèi)向電流的作用。在電壓鉗模式下,細胞被鉗制在-60 mV,用C48/80持續(xù)作用HMC-1細胞或者P815細胞,兩種細胞均產(chǎn)生明顯的內(nèi)向電流。OT預處理兩種細胞后,C48/80誘導細胞產(chǎn)生的內(nèi)向電流均明顯減小5.0TR拮抗劑和一氧化氮合酶(nitrio oxide synthase,NOS)抑制劑對0T作用的影響用OTR的阻斷劑阿托西班(atosiban)或者非選擇性NOS抑制劑NG-Methyl-L-arginine acetate salt(L-NMMA)預處理后,OT對C48/80誘導P815細胞組胺釋放的抑制作用被顯著逆轉,OT對C48/80誘導HMC-1細胞和P815細胞內(nèi)向電流的抑制作用同樣被顯著逆轉。6.0T對肥大細胞內(nèi)鈣離子的影響用Fura-2作為鈣離子的熒光染料,用鈣成像設備分別記錄340 nm和380 nm激發(fā)出的發(fā)射光強度值F340和F380,以F340/F380的比值來體現(xiàn)胞內(nèi)鈣離子的水平。不同濃度的OT作用HMC-1細胞或者P815細胞后,細胞內(nèi)鈣離子濃度呈劑量依賴性增高。結論1.肥大細胞上表達OTR,潰瘍性結腸炎患者以及TNBS誘導的結腸高敏感模型大鼠的結腸組織中表達OTR的肥大細胞比例均顯著增高。2.外源性OT可抑制結腸高敏感大鼠的結腸肥大細胞脫顆粒,進而發(fā)揮對結腸高敏感性的抑制作用。3.外源性OT可能通過Ca2+-NOS信號通路抑制肥大細胞脫顆粒。第二部分：縮宮素對正常大鼠背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元興奮性的影響及其機制研究目的OT在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中發(fā)揮著重要的鎮(zhèn)痛作用。然而,OT在外周的鎮(zhèn)痛作用雖然也有報道,但機制不清。本研究的目的是探討OT對DRG神經(jīng)元電生理特性的影響,以期揭示OT鎮(zhèn)痛的外周神經(jīng)系統(tǒng)機制。方法急性分離DRG神經(jīng)元并培養(yǎng)。通過鈣離子成像技術,檢測細胞內(nèi)鈣離子的變化。運用全細胞膜片鉗技術,記錄DRG神經(jīng)元的電生理特性。免疫熒光實驗用于檢測OTR和神經(jīng)型一氧化氮合成酶(neuronal nitric oxide synthase,nNOS)在DRG神經(jīng)元中的表達及分布。采用免疫熒光實驗和硝酸還原酶法檢測DRG神經(jīng)元內(nèi)一氧化氮(nitric oxide,NO)的含量。結果1.OT對DRG神經(jīng)元興奮性的影響OT能夠明顯降低小型DRG神經(jīng)元(直徑20-27μM)的興奮性,這可能跟OT使外向電流增大,引起細胞膜超極化有關。OT作用小型DRG神經(jīng)元后,能夠引發(fā)動作電位的閾刺激強度顯著增大,而且同等強度的刺激下(正常情況下2倍或者3倍閾刺激強度)引發(fā)動作電位的數(shù)量明顯減少。此外,OT可使電壓誘導的外向電流顯著增大,并可引起細胞膜超極化。2.nNOS抑制劑對OT引起DRG神經(jīng)元超極化的影響用選擇性的nNOS抑制劑N-Propy1-L-arginine(NPLA)預處理細胞,可以明顯降低OT引起的DRG神經(jīng)元超極化。3.OT對DRG神經(jīng)元胞內(nèi)NO含量的影響免疫熒光和硝酸還原酶法監(jiān)測NO的方法均顯示,OT能夠顯著提高大鼠急性分離的DRG神經(jīng)元和DRG組織內(nèi)NO含量。用選擇性的nNOS抑制劑NPLA預處理細胞,可以明顯逆轉OT引起的大鼠DRG組織內(nèi)和急性分離的DRG神經(jīng)元胞內(nèi)NO含量的升高。4.OTR和nNOS在痛覺相關性DRG神經(jīng)元上共表達免疫熒光實驗發(fā)現(xiàn),大于85% IB4標記的痛覺相關性神經(jīng)元上,同時表達OTR和iNOS。5.三磷酸腺苷敏感性鉀通道(adenosine triphosphate sensitive potassium channel,KATP)的阻斷劑對OT電生理作用的影響KATP的阻斷劑格列本脲(glibenclamide)明顯減弱OT引起的大鼠DRG神經(jīng)元超極化和外向電流增大的效應。6.OT對DRG神經(jīng)元胞內(nèi)鈣離子的影響OT可以引起小型DRG神經(jīng)元胞內(nèi)鈣離子劑量依賴性的增加。結論1.OTR和nNOS在IB4標記的痛覺相關性DRG神經(jīng)元上共表達。2.OT能夠引起小型DRG神經(jīng)元細胞膜超極化并顯著降低其興奮性,進而發(fā)揮外周鎮(zhèn)痛作用。3.OT可能通過激活DRG神經(jīng)元內(nèi)Ca2+/nNOS/NO/KATP信號通路,引起細胞膜超極化。
【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R33
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本文編號：1311080