本文關(guān)鍵詞：鴨腸炎病毒UL13蛋白激酶活性與核定位特性研究　出處：《四川農(nóng)業(yè)大學(xué)》2016年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

  更多相關(guān)文章： 鴨腸炎病毒中國強(qiáng)毒株 UL13基因 激酶活性 核定位分析 重組病毒

【摘要】：鴨腸炎病毒(duck enteritis virus, DEV)是皰疹病毒科(Herpesviridae)、α皰疹病毒亞科(Alphaherpesvirinae)、馬立克氏病毒屬(Mardivirus)的成員之一。UL13基因編碼的蛋白是皰疹病毒保守性蛋白激酶(Conserved herpesvirus protein kinase, CHPK)家族成員之一。目前有關(guān)DEV UL13功能研究的資料尚很缺乏,因此作者對其進(jìn)行了生物信息特征、原核表達(dá)及多克隆抗體的制備、UL13蛋白激酶活性、細(xì)胞內(nèi)定位、核定位特性、功能等方面的研究,主要結(jié)果如下：1鴨腸炎病毒CHv株UL13基因生物信息特征DEV UL13基因完整ORF為1575bp,編碼含524個氨基酸的肽段,整條肽鏈不具備信號肽和跨膜區(qū),有潛在的糖基化位點9個和磷酸化位點34個,有兩個潛在的核定位信號分別位于肽段4-7及90-96位氨基酸殘基處,296-305氨基酸位點顯示為潛在核輸出信號。密碼子分析顯示UL13基因偏向使用A/T結(jié)尾的密碼子,密碼子使用模式與酵母的最為接近。DEV UL13蛋白的二級結(jié)構(gòu)分析顯示其有多個抗原決定簇,均勻分布在整條肽鏈中,三級結(jié)構(gòu)預(yù)測其與皰疹病毒的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶家族成員高度相似,屬于皰疹病毒保守性蛋白激酶家族成員之一,通過序列比對其179位氨基酸為激酶發(fā)揮最大活性所必需的保守性賴氨酸位點。2鴨腸炎病毒UL13基因克隆、原核表達(dá)及多克隆抗體的制備將DEV UL13基因第486-1158位堿基序列克隆至原核表達(dá)載體pET32c(+)上,將重組表達(dá)載體導(dǎo)入大腸桿菌BL21(DE)中進(jìn)行融合表達(dá),通過對表達(dá)條件進(jìn)行優(yōu)化,確定了30℃、IPTG濃度為0.2 mM誘導(dǎo)表達(dá)5h能獲得最高表達(dá)量。獲得了大小約44 kDa帶His標(biāo)簽的UL13非可溶形式的包涵體蛋白。該表達(dá)蛋白能被兔抗DEV多克隆抗體特異性識別。用親和層析的方法純化UL13重組蛋白,復(fù)性后免疫兔子獲得兔抗DEV UL13蛋白血清,能特異性識別感染細(xì)胞中的DEV。3鴨腸炎病毒UL13基因類型及轉(zhuǎn)錄、表達(dá)時相分析為確證鴨腸炎病毒UL13的基因類型,首先用更昔洛韋和放線菌酮分別處理感染了DEV的細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)DEV UL13的表達(dá)僅對放線菌酮處理敏感,完全不依賴病毒的復(fù)制,說明DEV UL13為早期基因。通過反轉(zhuǎn)錄實時熒光定量PCR對DEV UL13基因的轉(zhuǎn)錄實相特征進(jìn)行探索,結(jié)果表明UL13基因從病毒感染后2 h開始轉(zhuǎn)錄,24 h轉(zhuǎn)錄水平達(dá)到峰值,其相對宿主細(xì)胞β-actin基因轉(zhuǎn)錄水平從病毒感染后2 h起逐步上升,48 h達(dá)到峰值。同時用免疫印跡方法對DEV UL13蛋白表達(dá)時相進(jìn)行探索,發(fā)現(xiàn)在病毒感染后4 h能被檢測到,24 h表達(dá)水平達(dá)到峰值,UL13基因表達(dá)與轉(zhuǎn)錄水平的動態(tài)變化基本一致。4鴨腸炎病毒UL13蛋白激酶活性研究通過桿狀病毒昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)對DEV UL13蛋白和對激酶活性發(fā)揮至關(guān)重要的保守性賴氨酸突變的DEV △UL13(K179M)蛋白進(jìn)行了體外真核表達(dá)及純化,測定及比較了DEV UL13蛋白和DEV △UL13(K179M)蛋白體外激酶活性的差異,并確定了DEV UL13在體外發(fā)揮最適酶活條件為50 mM Mg2+存在、pH7.2、37℃；同時純化了UL13潛在底物蛋白,病毒編碼的糖蛋白gE和Us3蛋白激酶,通過體外激酶反應(yīng)初步確定Us3蛋白能被UL13蛋白磷酸化。為了進(jìn)一步確定UL13蛋白對Us3蛋白的磷酸化能力、探索UL13蛋白激酶活性對病毒生長復(fù)制的影響,通過本實驗室新構(gòu)建的DEV感染性克隆平臺,成功構(gòu)建了UL13蛋白第179位賴氨酸突變?yōu)榧琢虬彼岬狞c突變重組毒DEV CHv-BACAUL13(K179M)及回復(fù)突變毒DEVCHv-BAC△UL13(K179M) R。通過對DEV CHv-BACAUL13(K179M)重組毒與回復(fù)毒DEV CHv-BACAUL13(K179M) R、親本毒DEV CHv-BAC進(jìn)行體外生物學(xué)特性比較,發(fā)現(xiàn)UL13蛋白激酶失活毒株在病毒的復(fù)制能力及空斑形成方面不及親本毒和回復(fù)毒株,說明UL13激酶活性對病毒的生長復(fù)制有重要影響,同時通過免疫印跡的方法確定DEVUL13蛋白在病毒感染的細(xì)胞內(nèi)也能磷酸化Us3蛋白。5鴨腸炎病毒UL13基因編碼蛋白的定位研究通過間接免疫熒光法探究DEV UL13蛋白在感染細(xì)胞內(nèi)的定位情況,結(jié)果發(fā)現(xiàn)UL13蛋白在感染細(xì)胞的核、質(zhì)中均有分布。為了確定主導(dǎo)UL13蛋白入核的功能信號,先通過重疊PCR技術(shù)構(gòu)建了UL13蛋白潛在的核定位信號單/雙缺失的突變子與GFP的融合表達(dá),發(fā)現(xiàn)與天然UL13融合GFP重組蛋白相比,核定位信號單/雙缺失的重組蛋白大量/全部在胞漿滯留,而且通過將核定位信號1或/和2與GFP融合表達(dá),發(fā)現(xiàn)綠色熒光大量/幾乎全部位于胞核。說明核定位信號1和2對于DEV UL13蛋白的入核不可或缺,且二者具有協(xié)同作用。同時通過藥物抑制試驗確定了UL13的核定位信號是通過與importin α/β形成復(fù)合物來調(diào)節(jié)UL13蛋白入核的。用相同的操作探究DEV UL13潛在的核輸出信號功能,發(fā)現(xiàn)其缺失或添加并不能引起綠色熒光分布的任何變化,表明核輸出信號是非功能性的。為了進(jìn)一步探索DEV UL13蛋白入核的功能,作者通過本實驗室新構(gòu)建的DEV感染性克隆平臺,成功構(gòu)建了UL13蛋白缺失了核定位信號的重組毒DEV CHv-BAC UL13-ANLS。通過對DEV CHv-BAC UL13-△NLS與親本毒DEV CHv-BAC進(jìn)行體外生物學(xué)特性比較,發(fā)現(xiàn)DEV CHv-BAC UL13-△NLS重組毒在病毒的復(fù)制能力及空斑形成方面與親本毒并無明顯差異,說明UL13蛋白不入核對病毒的生長復(fù)制沒有重大影響。通過免疫印跡法比較親本毒和DEV CHv-BAC UL13-△NLS、DEV CHv-BAC△UL13(K179M)重組毒感染后Us3蛋白的磷酸化水平發(fā)現(xiàn)缺失了核定位信號的DEV UL13蛋白依然能磷酸化Us3蛋白,說明核定位信號的缺失不影響激酶活性。6鴨腸炎病毒UL13缺失重組毒構(gòu)建及體外細(xì)胞培養(yǎng)特性研究為了探索DEV UL13蛋白影響病毒復(fù)制是否完全依賴其激酶活性的發(fā)揮,本章依賴細(xì)菌人工染色體DEV重組病毒拯救系統(tǒng)平臺,通過兩步Red重組系統(tǒng)構(gòu)建了兩個UL13蛋白部分缺失的感染性克隆,并成功拯救出UL13缺失的重組毒DEVCHv-BAC△UL13及部分缺失的重組毒DEV CHv-BAC△UL13-1(僅缺失UL13肽鏈激酶活性區(qū)域Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ亞域)和DEV CHv-BAC△UL13-2(僅缺失UL13肽鏈激酶活性區(qū)域Ⅵ、Ⅶ、Ⅸ亞域)。經(jīng)測序鑒定及RFLP分析,這三株重組毒基因組除了人工誘發(fā)的突變外,其余與親本無異。三株重組毒所形成的空斑明顯小于親本毒,生長復(fù)制能力也明顯弱于親本毒,這種差異在DEV CHv-BAC△UL13-2重組毒上表現(xiàn)尤為明顯,而DEV CHv-BAC△UL13及部分缺失的重組毒DEV CHv-BAC△UL13-1與第四章構(gòu)建的點突變重組毒株DEV CHv-BAC△UL13(K179M)在空斑形成及復(fù)制能力上并無明顯差異。表明DEV UL13蛋白在病毒復(fù)制周期中發(fā)揮重要作用,且其功能的發(fā)揮多半依賴其激酶活性。
【學(xué)位授予單位】：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S852.65
，

本文編號：1309341