本文關鍵詞：趨磁細菌MSR-1磁小體膜蛋白相互作用網絡構建及MamA的功能解析　出處：《中國農業(yè)大學》2016年博士論文　論文類型：學位論文

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【摘要】：趨磁細菌(magnetotactic bacteria, MTB)是一類能夠依靠胞內鏈狀排列的磁小體(magnetosome)而感知地磁場,進行定向運動,以尋找適宜生境的原核生物的統(tǒng)稱。趨磁細菌的磁小體是由生物膜包被的Fe304或Fe3S4晶體,磁小體的合成過程屬于生物礦化過程,這一過程受到細胞的嚴格控制。磁小體生物合成的分子機制是趨磁細菌研究的最大熱點,磁小體膜上已確定的特有蛋白有20～40種,這些蛋白分別被命名為磁小體膜(magnetosome membrane, Mam)蛋白。這些Mam蛋白在磁小體的合成中發(fā)揮重要的作用,但它們在磁小體合成過程中是否相互聯(lián)系呢?執(zhí)行這一過程時哪些蛋白處于關鍵位置呢?為解答這些問題,本研究以趨磁螺菌Magnetospirillum gryphiswaldense MSR-1為出發(fā)菌株,構建選定的17個Mam蛋白之間的相互作用網絡,并從網絡中尋找到在磁小體合成過程中發(fā)揮重要功能的MamA、MamS和MamT蛋白,進一步確定它們之間的蛋白相互作用,并研究這三個基因是如何參與磁小體的合成過程的。本論文分四部分展開。第一部分,為篩選Mam蛋白之間的蛋白相互作用,構建了17個Mam蛋白用于細菌雙雜交系統(tǒng)蛋白相互作用篩選的載體,進行蛋白相互作用初篩,共篩選到62對可能有相互作用的蛋白,半乳糖苷酶活測定結果顯示,MamA與MamS和MamT表現(xiàn)出的酶活比細菌雙雜交系統(tǒng)正對照高一倍以上。通過Cytoscope分析酶活測定后的蛋白相互作用網絡,聚簇分析表明MamA、MamS、MamT、MamO、MamK這五個蛋白聚成一組,說明這幾個蛋白之間緊密聯(lián)系,且在磁小體合成這一生物學過程中發(fā)揮重要作用。第二部分,為尋找MamA與MamS和MamT發(fā)生蛋白相互作用的位置對MamA蛋白進行N端截短突變并對另外兩個氨基酸進行了點突變。通過細菌雙雜交系統(tǒng)β-半乳糖苷酶活測定和大腸桿菌體內pull-down兩種方法,確定了完整的MamA與MamS和MamT之間確實存在相互作用,MamA與MamS發(fā)生相互作用的關鍵位點為MamA的第159位天冬氨酸；而MamT與MamA的蛋白相互作用與MamA蛋白N端前26個氨基酸有關。還通過細菌雙雜交系統(tǒng)β-半乳糖苷酶活測定和蛋白負染兩種方法確定MamA第50位精氨酸是MamA蛋白自身互作的關鍵位點。第三部分,為在趨磁細菌MSR-1中進一步確定MamA與MamS和MamT之間的蛋白相互作用,對mamS和mamT進行基因缺失突變并在突變株中對MamA與綠色熒光蛋白進行融合表達。初步分析突變株表型,透射電鏡(TEM)觀察結果表明,mamS缺失突變株中磁小體數(shù)目變少,成熟度降低；mamT缺失突變株中磁小體晶型結構遭破壞,但仍沿細胞長軸方向呈鏈狀排列。將MamA與綠色熒光蛋白的融合后,分別在野生型MSR-1和兩基因缺失突變株中表達,發(fā)現(xiàn)MamA-GFP在野生型中集中表達于細胞中央,方向與細胞長軸一致,而在mamS缺失突變株中融合蛋白的熒光彌散于整個細胞中,說明mamS缺失影響了MamA在趨磁細菌中的定位。第四部分,磁小體形成另一個重要因素為鐵,為確定趨磁細菌鐵吸收與Mam蛋白之間的聯(lián)系,構建與鐵的運輸、貯存相關的Bfr1, Bfr2, TolQ, FeoA1, FeoB1共5個蛋白用于細菌雙雜交系統(tǒng)蛋白相互作用篩選的載體,篩選這些蛋白與Mam蛋白之間的蛋白相互作用,初篩結果表明,與鐵相關的三個蛋白與MamA、MamS和MamT這幾個蛋白也有較密切的聯(lián)系,為進一步揭示MamA功能提供了一些線索。
【學位授予單位】：中國農業(yè)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：Q93

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